从印度一名急性弛缓性麻痹患者体内分离出的Echovirus 29菌株的分离及全基因组序列分析

《Microbiology Resource Announcements》：Isolation and complete genome sequence analysis of an Echovirus 29 strain isolated from a patient of Acute Flaccid Paralysis in India

E29病毒在印度阿科拉市急性弛缓性麻痹患儿粪便中检出，完成近完整基因组测序并提交GenBank（PXD230757.1）。该毒株与尼泊尔2023年分离株亲缘关系最近，氨基酸相似度达96%与1958年原型株，78-82%与巴西、危地马拉等2014年毒株。分析发现20个非同义突变，其中11个位于VP1-VP3结构蛋白。

　　

摘要

在印度马哈拉施特拉邦阿科拉市一名15个月大女孩的粪便样本中检测到了埃可病毒29型（E29），该女孩患有急性弛缓性麻痹。使用横纹肌肉瘤细胞分离出的E29菌株的完整基因组序列正在印度进行报告。

公告

埃可病毒29型（E29）是一种属于杯状病毒科的非包膜RNA病毒，可引发从无症状感染到脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹和呼吸系统疾病等多种病症（1）。此前在印度的脊髓灰质炎监测中也曾检测到E29病毒，且认为其与麻痹症有关（2, 3）。在马哈拉施特拉邦阿科拉的巴瓦尼普拉地区爆发后，通过qPCR和VP1测序在一名急性弛缓性麻痹患者的粪便样本中发现了E29病毒，并根据世界卫生组织的方案在RD细胞中成功分离出该病毒（4）。RD细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和抗生素的MEM培养基中培养；显示细胞病变效应（CPE）的感染细胞被收集并传代至P8细胞系。P4_E29菌株的完整基因组测序是在Illumina MiniSeq平台上完成的（5）。病毒RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit从培养上清液中提取。定量后，使用NEBNext depletion kit去除宿主rRNA，随后使用Qubit仪器纯化并测定RNA浓度。使用TruSeq Stranded mRNA kit（Illumina，美国）制备文库，并通过Tapestation进行检测。测序工作在Illumina MiniSeq（高产量试剂盒）上进行，FASTQ文件使用CLC Genomics Workbench v20进行分析。原始的配对端全基因组数据使用SPAdes genome assembler v3.15.5（6）和默认参数进行从头组装，得到一条长度为7,413 bp、GC含量为47.88%的基因组 contig。通过Enterovirus Genotyping Tool鉴定该印度分离株为E29型。

尽管组装后的基因组长度（7,413 nt）与参考序列一致，但由于缺乏RACE技术，无法确定其精确的5′和3′末端序列，因此将其报告为近乎完整的基因组。基因组注释使用VAPiD（v1.6.7）和默认设置完成，并通过BankIt提交至GenBank。使用BLASTn（NCBI）对共识基因组进行序列相似性分析，结果显示与尼泊尔的Enterovirus B（E29）菌株（GenBank登录号：PX230757）的序列相似度为99%，核苷酸同一性为86.76%。基于所有E29基因组构建的最大似然系统发育树通过MAFFT对齐，并在IQ-TREE中使用BIC选择的替代模型进行1,000次超快自助法分析，随后在iTOL中可视化。印度分离株（NIV2415257/IND/2025）以红色标出，与尼泊尔2023年的菌株（PP461528.1）聚类紧密（图1）。E29菌株与尼泊尔2023年的菌株以及巴西2014年的菌株属于同一支系。该菌株与1958年美国的原型菌株在核苷酸上具有79%的相似性，在氨基酸上具有96%的相似性，表明存在显著的核苷酸差异，但蛋白质结构保持保守。与危地马拉、海地、尼泊尔和巴西2014年的菌株相比，其核苷酸相似度为78–82%，而与两个高度分化的巴西菌株（2014–2015年）的相似度仅为30–32%。

图1

图1 基于E29菌株的完整基因组序列和从GenBank数据库检索的参考序列（美国1958年原型菌株，登录号：AY302552.1）构建的最大似然系统发育树。序列对齐使用MAFFT v7.5266和默认参数。系统发育树使用IQ-TREE v2.2.0和最大似然方法构建，最佳替代模型根据贝叶斯信息准则（BIC）自动选择。树的稳健性通过1,000次超快自助法复制进行评估。最终树形使用Interactive Tree of Life（iTOL v6）进行可视化和注释。印度分离株（NIV2415257/IND/2025）以红色字体标出，与PP461528.1/Nepal/2023菌株聚类紧密。

通过对GenBank中可用的九个全基因组序列进行全面的氨基酸水平突变分析，发现研究中的P4_E29菌株存在20个独特的非同义替换。在20个氨基酸替换中，有11个发生在结构蛋白上（表1）。本研究获得的完整P4_E29基因组序列已提交至GenBank，登录号为PX230757.1。

表1

表1 RD细胞系（NIV2415257/IND/2025）中分离出的E29菌株的独特氨基酸变化

样本ID	基因	基因组坐标	核苷酸变化	氨基酸变化	区域中的氨基酸位置	多聚蛋白中的氨基酸位置	HGVS表示法	突变类型
NIV2415257/IND/2025	VP4	65	aat → agt	N → S	22	22	p.N22S	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP2	233	tat → ttc	Y→ F	8	78	p.Y78F	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP2	649	aat → gat	N → D	147	217	p.N217D	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP2	676	cct → tct	P → S	156	226	p.P226S	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP2	680	aat → acc	N → T	157	227	p.N227T	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP2	691	gat → aat	D → N	161	231	p.D231N	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP3	1,168	gca → caa	A → Q	58	390	p.A390Q	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP3	1,690	gca → tca	A → S	232	564	p.A564S	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP3	1,700	ttc → tac	F → Y	235	567	p.F567Y	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP1	1,721	gcc → gtt	A → V	4	574	p.A574V	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	VP1	2,552	ggg → gtc	G → V	281	851	p.G851V	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2A	2,656	gca → aat	A → N	24	886	p.A886N	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2A	2,717	aca → atg	T → M	44	906	p.T906M	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2B	3,107	aac → agc	N → S	24	1,036	p.N1036S	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2B	3,284	cag → cgt	Q → R	83	1,095	p.Q1095R	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2C	3,334	gga → acc	G → T	1	1,112	p.G1112T	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2C	3,462	gaa → gac	E → D	43	1,154	p.E1154D	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	2C	3,959	att → acc	I → T	209	1,320	p.I1320T	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	3D	5,468	agc → aac	S → N	89	1,823	p.S1823N	非同义替换
NIV2415257/IND/2025	3D	6,310	gtc → ata	V → I	370	2,104	p.V2104I	非同义替换

致谢

本研究利用了印度医学研究委员会（ICMR）在PM-Ayushman Bharat Health Infrastructure Mission（PM-ABHIM）项目下开发的高性能计算设施“NAKSHATRA”（授权号：VIR/35/2025/ECD-1）进行生物信息学分析。作者感谢所有参与研究的患者，并感谢浦那ICMR-NIV主任在研究期间的支持。

M.S.J.：数据管理、正式分析、初稿撰写、研究调查、方法学研究；R.W.和P.U.：数据管理、正式分析、研究调查、方法学研究；A.J.：参与临床研究；A.F.A.负责系统发育和突变分析；N.K.、B.V.T.、S.C.和M.L.：概念构思、方法学设计、项目管理、资源协调及监督。

本研究得到了印度浦那ICMR-National Institute of Virology的支持。