MBD2作为相分离支架调控异染色质区室化的全基因组分析揭示其在异染色质动态与组成中的核心作用

《Nucleic Acids Research》：Heterochromatome wide analyses reveal MBD2 as a phase separation scaffold for heterochromatin compartmentalization and composition

本研究针对异染色质区室化的分子机制尚不明确的难题，通过整合空间蛋白质组学、相分离实验与机器学习预测工具，系统鉴定了MBD2作为异染色质相分离的关键支架蛋白。研究发现MBD2通过C端介导的寡聚化发生液-液相分离，形成液态凝聚体调控异染色质区室化，并招募组蛋白去乙酰化酶（如HDAC11、GATAD2b）同时排斥组蛋白乙酰转移酶（如Kat7），进而调控组蛋白H3K27和H3K9的去乙酰化状态。该研究深化了对异染色质区室化机制的理解，为染色质状态调控提供了新视角。

　　

在真核细胞的细胞核中，异染色质作为基因组的重要组成部分，以其高度压缩的状态和特定的表观遗传标记（如DNA甲基化和组蛋白H3K9me3）而著称。它主要分布在核周、着丝粒和端粒区域，对维持基因组稳定性、调控基因表达以及确保染色体正确分离至关重要。然而，尽管异染色质的重要性毋庸置疑，科学家们对其如何形成特定空间区室、如何动态维持其组成和功能的分子机制仍知之甚少。近年来，液-液相分离（LLPS）作为一种新兴的机制，被提出可能参与多种核内无膜细胞器（如核仁、核 speckle 等）的形成，也为理解异染色质的区室化提供了新的思路。一些已知的异染色质相关蛋白，如HP1α和MeCP2，已被证明具有相分离的能力。但是，异染色质作为一个复杂的蛋白质-DNA组装体，其相分离的“支架”蛋白（即能够驱动相分离发生的核心蛋白）全景图仍然模糊，单个蛋白如何通过相分离精确调控异染色质的组成和功能更是有待深入探索。

为了解开这些谜团，研究人员在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上发表了他们的最新成果。他们设想，将先进的细胞核分级分离技术与定量空间蛋白质组学、体外相分离实验以及基于机器学习的相分离蛋白预测工具相结合，或许能系统性地鉴定出参与异染色质区室化的候选相分离支架蛋白。为此，他们以小鼠大脑为模型，分离出异染色质组分，并通过体外相分离实验结合质谱分析，鉴定出约1000种与异染色质相关的蛋白质。利用预测工具，他们从中筛选出250个可能具有支架相分离特性的蛋白。通过基因本体论分析，进一步聚焦到20个定位于着丝粒周围异染色质区室的蛋白，其中就包括甲基-CpG结合域蛋白2（MBD2）。

研究团队综合利用体外相分离实验、蛋白质结构预测（AlphaFold Server）、细胞成像、荧光漂白恢复（FRAP）技术、蛋白质相互作用分析（Co-IP）以及定量质谱分析等多种关键技术方法。关键样本来源于小鼠脑组织分离的细胞核以及小鼠成肌细胞（C2C12）和小鼠胚胎干细胞（ES J1）系。

MBD2是着丝粒周围异染色质的候选相分离支架蛋白

研究人员通过整合多种预测工具和实验数据，发现MBD2是着丝粒周围异染色质中一个高置信度的候选相分离支架蛋白。体外实验表明，MBD2能够形成液态样的球形凝聚体，而其他MBD家族蛋白（如MBD1、MBD3、MBD4）的这种能力较弱或形成不规则聚集体。这表明MBD2在驱动异染色质相分离中可能扮演独特角色。

MBD2球形凝聚体的形成由其C端驱动并受CC结构域调节

为了解析MBD2相分离的分子决定因素，研究人员构建了系列截短体。研究发现，MBD2的羧基末端（C端）对于其形成球形凝聚体至关重要。特别是，C端内的卷曲螺旋（CC）结构域通过介导MBD2的同源寡聚化，在驱动相分离中发挥关键作用。而氨基末端（N端）则更多地影响凝聚体的形态，其甘氨酸/精氨酸（GR）重复区域可能通过增强分子内相互作用来调节相分离行为。MBD2存在三种主要异构体：包含MBD（甲基-CpG结合域）、TRD（转录抑制域）和C端的MBD2a（全长）；缺少N端的MBD2b；以及缺少C端的MBD2c。体外实验证实，MBD2a和MBD2b能形成液态凝聚体，而MBD2c则不能。

MBD2a/b球形凝聚体在着丝粒周围异染色质区室周围产生界面屏障

在细胞模型中，研究人员发现MBD2a和MBD2b能够在着丝粒周围异染色质区室周围建立明显的界面屏障，这通过半荧光漂白恢复（half-FRAP）和荧光漂白丢失（FLIP）实验得以验证。这种界面屏障限制了异染色质区室与周围核质之间的分子自由交换，表明MBD2a/b形成的凝聚体具有典型的液-液相分离特征。而MBD2c则无法形成有效的屏障。

MBD2液态球形凝聚体调控异染色质的组成

那么，MBD2形成的相分离凝聚体如何影响异染色质的组成和功能呢？研究人员将纯化的MBD2凝聚体与分离自小鼠脑的异染色质组分共同孵育进行体外相分离实验，并通过质谱分析蛋白质组成的变化。他们发现，MBD2凝聚体的存在会特异性招募一部分蛋白质（如组蛋白去乙酰化酶相关蛋白）进入异染色质凝聚体，同时排斥另一部分蛋白质（如组蛋白乙酰转移酶相关蛋白）。这表明MBD2通过相分离主动地“筛选”和“组织”着丝粒周围异染色质的蛋白质组成。

MBD2a/b通过相分离驱动的分子排斥和包裹调控异染色质表观遗传状态

功能上，MBD2a和MBD2b的过表达能显著降低着丝粒周围异染色质区域的组蛋白H3第27位（H3K27ac）和第9位（H3K9ac）赖氨酸的乙酰化水平。机制上，Co-IP和共定位分析表明，MBD2a/b能与组蛋白去乙酰化酶HDAC11相互作用并将其招募至异染色质，同时排斥组蛋白乙酰转移酶Kat7。反之，MBD2基因敲除则导致异染色质区室中H3K27ac和H3K9ac水平的升高。这些结果清晰地表明，MBD2a/b通过相分离机制，在着丝粒周围异染色质区室建立并维持一个低乙酰化、转录抑制的环境。

综上所述，这项研究通过多学科交叉的方法，不仅建立了一个强大的平台来识别异染色质相关的相分离支架蛋白，还深入揭示了MBD2作为一个关键支架，如何通过其固有的相分离能力来驱动异染色质的区室化，并精确调控其组成和表观遗传状态。该研究强调了相分离，特别是由特定支架蛋白驱动的液-液相分离，在染色质高级结构组织和功能调控中的核心作用。由于MBD2的功能异常与多种疾病（如癌症）相关，这些发现也为理解相关疾病的发病机制和开发新的治疗策略提供了新的理论基础和潜在靶点。