PDZ6从PDZD2的折叠路径中三个过渡态的结构解析

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Structural Dissection of Three Transition States Along the Folding Pathway of PDZ6 from PDZD2

PDZ6的折叠机制通过动力学实验和φ值分析揭示，发现其存在三个过渡态（TS1-TS3），并证实中心β链是成核核心，同时比较了同源PDZ域的折叠共性。

　　

Cosmin Marian Obreja | Dimitrios Marinidis | Valeria Pennacchietti | Sara Di Matteo | Rodolfo Ippoliti | Francesca Malagrinò

阿奎拉大学临床医学、公共卫生、生命与环境科学系，意大利拉奎拉市Vetoio路67100号Coppito

摘要

蛋白质折叠的协同性质限制了对反应机制的实验分析。PDZ结构域具有保守的折叠结构、大量的同源蛋白以及可访问的折叠中间体，是研究折叠路径的理想模型。本文详细分析了PDZD2中的PDZ6的折叠路径，通过在不同盐浓度条件下的动力学实验结合φ值分析，揭示了PDZ6复杂的能量景观，包括三个明显的过渡态（TS1–TS3），以及沿反应坐标逐渐获得天然结构的过程。利用大量PDZ结构域的同源性，我们将保守结构位置的φ值与先前获得的PSD-95的PDZ3和PTP-BL的PDZ2的φ值进行了比较。分析表明，PDZ结构域之间存在共同的折叠机制，其中中央的β链作为折叠的核心。总体而言，这项工作首次揭示了控制PDZ6折叠的三个过渡态的结构特征，并强调了PDZ结构域之间保守的、分层的折叠机制。这些发现扩展了我们对PDZ折叠原理的理解，可能为研究其功能调节和进化适应提供依据。

引言

尽管最近仅凭序列信息预测蛋白质结构方面取得了显著进展，但理解蛋白质如何折叠成其天然三维结构仍然是结构生物学中的一个核心挑战[1]。在解析折叠机制时，一个关键难点在于蛋白质折叠的固有协同性——尽管折叠过程中涉及蛋白质内部以及蛋白质与溶剂之间数百个弱非共价相互作用的形成和断裂，但它通常以高度协调的“全有或全无”方式发生。这一特性常常限制了对过渡态中间体的实验研究，阻碍了折叠路径和结构事件顺序的详细重建。

为克服这一限制，两种互补策略被证明特别有效。首先，关注那些具有多个可检测折叠状态的蛋白质（如中间体或平行折叠路径）具有重要意义，因为这些状态有可能揭示折叠过程中的隐藏步骤[2][3]。其次，通过研究同一结构家族中的同源蛋白质（即具有保守拓扑结构但在结构、稳定性或动力学上存在差异的蛋白质），理论上可以归纳出折叠机制的一般原理和保守特征[4][5]。PDZ结构域就体现了这两种方法。这些小而丰富的蛋白质-蛋白质相互作用结构域在支架蛋白和信号蛋白中广泛存在，通常由五个β链和两个α螺旋组成[6][7]。值得注意的是，许多PDZ结构域的折叠过程涉及复杂的能量景观，包括部分折叠的中间体和多个过渡态[8][9]。此外，大量同源PDZ结构域的存在便于进行基于结构保守位置的比较突变研究[5][10]。

在本研究中，我们分析了PDZD2中的PDZ6的折叠机制，该结构域此前已被发现与前列腺癌有关[11]。与其他许多PDZ结构域不同，PDZ6具有可变的中间体数量，且可以通过改变实验条件选择性地稳定这些中间体[12]。这一特性使得PDZ6成为利用Φ值分析详细解析折叠转变的理想对象。该方法通过在蛋白质特定位置引入小的、明确的突变，并监测这些变化对天然状态和过渡态自由能的影响来实现[13][14]。通过结合两种不同离子强度下的Φ值分析以及对同源PDZ结构域中保守残基的比较研究，我们重建了沿折叠路径的结构组织过程，并探讨了PDZ家族中存在的保守的、分层的折叠机制。

实验设计与PDZD2中PDZ6结构域的定点突变

我们对PDZD2中的PDZ6进行了Φ值分析。突变策略的目的是获取PDZ6在过渡态下的结构信息。为避免引入重大结构破坏，突变设计旨在微妙地破坏特定相互作用，而不显著扰乱蛋白质的整体折叠或产生新的稳定相互作用。通常，这是通过逐步截短埋藏在蛋白质核心中的疏水侧链来实现的

PDZD2中PDZ6的φ值分析

研究给定反应路径上亚稳态结构的一种有效方法是，通过定点突变扰动局部结构的同时研究其动力学行为。这种方法构成了所谓的Φ值分析的基础，它通过测量特定点突变对折叠和展开速率常数的影响来推断高能状态的结构组织。此外，在不同条件下应用Φ值分析可以

讨论

PDZ结构域是广泛存在的蛋白质-蛋白质相互作用模块，在细胞组织和信号传导中起着关键作用[19]。尽管它们的结构具有保守性，但其折叠机制仍不完全清楚，尤其是在控制折叠特异性和动力学的过渡态集合方面[20]。本文对PDZD2中的PDZ6进行了深入的动力学和结构分析，该结构域此前已被证明会形成过渡态中间体[12]。通过

CRediT作者贡献声明

Francesca Malagrinò：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，监督，方法学，研究设计，资金获取，数据分析，概念化。Rodolfo Ippoliti：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，资金获取。Dimitrios Marinidis：撰写 – 初稿，验证，方法学，资金获取，数据分析。Cosmin Marian Obreja：撰写 – 初稿，验证，方法学，数据分析。

资助

本研究得到了拉奎拉大学（Progetto di Ateneo 2024 – Avvio alla Ricerca）对FM的资助，拉奎拉大学生命、健康与环境科学系对FM的资助，以及欧盟（下一代欧盟计划，Mission 4 Componente 2 CUP F83B2200004000）对DM的资助。

利益冲突声明

所有作者均声明无利益冲突。