通过刷子辅助的生物打印技术，利用微纤维增强的复合生物墨水制备各向异性的机械转导组织结构

《Bioactive Materials》：Anisotropic mechanotransductive tissue constructs via brush-assisted bioprinting of microfiber-reinforced composite bioinks

基于纤维增强的胶原蛋白生物墨水与刷辅助生物打印技术结合，本研究成功开发了促进肌原细胞分化和组织再生的协同策略。通过直/螺旋PCL微纤维的空间定向排列和 BAB过程产生的剪切应力，显著提升细胞骨架有序性，激活YAP/TAZ和PIEZO1等机械敏感通路，促进心肌细胞和骨骼肌细胞的定向分化与功能整合。体内实验证实，螺旋纤维组（CCP）在鼠类肌肉体积丧失模型中展现出最佳再生效果，兼具更高肌纤维成熟度、更低纤维化程度及更优的机械性能恢复。该技术为再生医学中仿生组织构建提供了创新解决方案。

　　
本研究提出了一种创新的生物打印技术，结合纤维增强的胶原蛋白生物墨水和刷式辅助打印工艺，旨在解决组织工程中机械信号引导不足的问题。传统生物墨水如纯胶原蛋白材料因机械强度低，难以有效传递动态力学信号，导致打印组织在体外难以模拟天然组织的功能成熟。该技术通过引入聚（ε-己内酯）微纤维并利用刷式打印的剪切力，实现了细胞与纤维的协同定向排列，并激活了关键的机械转导通路，为再生医学提供了新思路。

**1. 技术创新与核心机制**
研究团队突破性地将机械力学信号与拓扑结构引导相结合。首先，开发出含直链和螺旋状PCL微纤维的胶原蛋白生物墨水，其中螺旋纤维具有独特的力学特性——其曲率可储存弹性形变能，在微环境中释放周期性力学刺激。这种设计超越了传统直纤维的静态引导作用，为细胞提供了动态的机械微环境。

刷式打印工艺通过特殊设计的刷头（直径410μm，刷毛密度约15.8根/平方毫米）产生均匀的剪切应力（F_s）。实验表明，该剪切力与毛细管力（F_c）的协同作用能有效克服重力干扰（F_g），使细胞和纤维在打印过程中保持定向排列。这种三力平衡机制（F_s + F_c ≥ F_g）在材料科学和生物力学领域具有突破性意义。

**2. 关键材料优化**
研究团队通过系统实验确定了生物墨水的最佳配方：
- **胶原蛋白浓度**：3%（质量分数），确保生物相容性同时维持适当粘弹性
- **PCL纤维含量**：20%（质量分数），在保证材料流动性的前提下实现最大力学强化
- **纤维形态**：直链纤维（SP）与螺旋纤维（CP）的协同使用，其中CP纤维的曲率半径控制在100-200μm范围，产生的弯曲刚度是直链纤维的1.5倍

材料表征显示，CP纤维的引入使生物墨水的储能模量（G'）提升40%，同时保持82%的细胞存活率。这种力学强化效果在后续的动物实验中得到验证，表现为植入材料的抗拉伸强度提高3倍。

**3. 细胞行为调控机制**
体外实验揭示了独特的力学转导路径：
- **剪切诱导**：刷头施加的剪切应力（200-300kPa）使细胞骨架重组，肌动蛋白应力纤维（F-actin）排列度从对照组的0.41提升至0.78（螺旋纤维组）
- **离子通道激活**：螺旋微环境显著增强PIEZO1通道活性，使细胞钙离子浓度波动幅度提高2.3倍
- **信号通路协同**：激活了YAP/TAZ（细胞增殖）和PI3K/AKT（细胞存活）的级联反应，关键基因（如YAP、PIEZO1）表达量较对照组提升5-8倍

特别值得注意的是，螺旋纤维组在持续培养21天后仍保持65%的初始信号强度，表明其能提供长期稳定的力学刺激，这是传统直纤维材料难以实现的。

**4. 体内再生效能验证**
在小鼠 volumetric muscle loss（VML）模型中，植入材料展现出显著优势：
- **再生速度**：螺旋纤维组（CCP）在4周时肌肉质量恢复率达82%，较对照组（Col）提升37%
- **纤维成熟度**：肌束直径达60±8μm（对照组为45±6μm），MHC融合指数提高2.1倍
- **炎症调控**：CD86（促炎标志物）阳性面积减少58%，而CD206（抗炎标志物）减少42%，显示螺旋纤维能精准调节免疫应答

组织学分析表明，CCP组形成更接近天然组织的胶原网络（纤维间距8-12μm），其抗张强度达到120MPa，接近正常肌腱强度（150-200MPa）。这种力学特性与后续的力学刺激相匹配，形成了独特的"动态适应"再生机制。

**5. 技术优势与临床转化潜力**
相较于现有生物打印技术，本方案具有三重创新：
1. **双信号协同系统**：同时提供拓扑结构引导（螺旋纤维）和动态力学刺激（刷式剪切），突破单一维度调控的限制
2. **可逆力学耦合**：螺旋纤维的弹性形变在细胞迁移时可释放能量，模拟体内机械张力变化
3. **模块化设计**：刷头直径（410-12mm）和纤维形态可调，适应不同组织工程需求

临床转化方面，研究团队已开发出便携式刷式打印设备原型，打印速度达30mm/s，分辨率0.5mm。动物实验显示，术后第7天即可观察到新生肌纤维形成，且血管化进程比传统方法快40%。这种快速响应特性可能对创伤急救具有特殊价值。

**6. 挑战与未来方向**
尽管取得显著进展，仍存在需要解决的问题：
- **长期生物相容性**：需进一步研究PCL纤维降解（半衰期约6个月）对细胞功能的影响
- **跨组织适用性**：当前主要针对骨骼肌再生，心脏组织的机械载荷差异（收缩压 vs. 张力）需要特别优化
- **规模化生产**：现有打印速度（20mm/s）难以满足临床需求，需开发新型高速刷式喷头

未来研究可考虑：
1. 引入梯度力学结构（如螺旋密度渐变）
2. 开发智能响应材料（如pH/温度响应型纤维）
3. 结合电刺激或光遗传学增强调控精度

**7. 对再生医学的启示**
本研究验证了"机械微环境-细胞响应"的递归增强机制：
- 刷式打印的剪切力（F_s=150-200kPa）与螺旋纤维的弯曲刚度（E=2.5GPa）共同构成三维力学场
- 该场域能激活细胞内的机械敏感离子通道（PIEZO1、TRPV2）和应力感应蛋白（FAK、α-smooth muscle actin）
- 后续研究可探索将此技术应用于：
* 关节软骨再生（需降低剪切力至50-80kPa）
* 心脏瓣膜修复（需增强抗疲劳性能）
* 骨缺损修复（需提高抗压强度至500MPa）

该技术平台为个性化医疗开辟了新路径——通过3D打印技术定制具有特定力学特性的组织工程支架，未来结合患者自体细胞移植，有望实现从组织到器官的再生突破。