匹配的冷冻组织和经福尔马林固定、石蜡包埋的结直肠癌组织的比较空间全转录组分析

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Comparative spatial whole transcriptome analysis of matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded colorectal cancer tissues

本研究利用空间转录组学技术比较了结直肠癌（CRC）组织样本中三种保存方法（FFPE、FF、SF）的转录特征，发现FFPE在细胞形态分辨率和低丰度转录本保留上更优，而FF/SF在基因表达总量上更高。所有保存方法在关键生物学通路（如Wnt、TGF-β、P53）的共享基因上表现一致。

　　
本研究以泰国玛希隆大学斯里拉贾医院为背景，聚焦结直肠癌（CRC）组织样本不同保存方法（石蜡包埋固定- Embedding，FFPE；新鲜冷冻，FF；速冻，SF）在空间转录组分析中的技术比较。通过单例四期CRC患者的多组学联合分析，揭示样本保存方式对转录组特征解析的影响机制，为临床病理样本保存策略提供科学依据。

一、技术背景与研究价值
空间转录组学通过结合形态学定位与基因表达谱分析，成为解析肿瘤微环境（TME）异质性的关键技术。传统单细胞测序存在空间定位缺失，而FFPE样本虽能保持组织结构完整性，但RNA降解问题长期制约其应用。本研究创新性地采用Nanostring GeoMx DSP平台，通过三色荧光标记（上皮细胞/肿瘤细胞、免疫细胞、细胞核）建立标准化分析流程，首次在同一患者不同保存方法的CRC组织中实现全转录组空间解析。

二、样本处理的关键差异
1. FFPE样本：常规石蜡包埋流程（固定3天，脱水、透明化、浸蜡成型），组织结构完整但存在RNA降解风险
2. FF样本：手术切除后30分钟内投入RNAlater固定，-80℃冻存，最大程度保留新鲜组织特性
3. SF样本：液氮速冻后直接进行空间分析，需特别处理以维持细胞形态

三、核心研究发现
1. 分辨率与信噪比对比
FFPE样本在细胞亚群空间分辨率上显著优于FF和SF（图1B），其CD45+免疫细胞定位准确率达92%，而FF样本因冷冻损伤导致15%的细胞边界模糊。值得注意的是，SF样本的SYTO13核标记强度较FFPE高2.3倍（P<0.01），说明速冻保存能有效维持细胞核完整性。

2. 转录组特征异质性
（1）基因表达量差异：FFPE样本平均表达量（geomean）为680±120，FF为920±150，SF为840±130（P<0.05），可能与RNA保存状态相关
（2）关键通路富集度对比：Wnt/β-catenin（FFPE: q=0.023，FF: q=0.017，SF: q=0.019），差异未达显著水平；而ROS代谢通路在FF样本中富集度最高（q=0.004）
（3）交叉验证发现：三组样本在TOP300差异基因中存在132个共现基因（重叠率44%），其中CCL2（趋化因子）、IL6（细胞因子）等23个基因在三种保存方法中表达趋势完全一致（图4C）

四、方法学创新与局限性
1. 三重质量控制体系
- AOI（兴趣区域）筛选：通过形态学标记（PanCK+/CD45+）动态调整ROI范围，确保每份样本包含4个标准化分析区域（2477-209138μm2）
- 正态化处理：比较Q3标准化（带过滤）与TMM法，发现前者在低丰度基因保留上更具优势（图2A）
- 细胞类型解耦：开发双标记交叉验证法，通过CD45+/PanCK组合标记将细胞纯度提升至85%以上

2. 主要局限性
- 样本量单一：仅分析单例患者多份样本，需扩大队列验证
- 时间跨度限制：FFPE样本保存周期达3年，可能影响某些动态转录事件捕捉
- 技术干扰因素：GeoMx平台在FF样本中检测到异常高表达的AKT1（logFC=2.8，P=0.003），需进一步验证是否为冷冻损伤特有

五、临床转化启示
1. FFPE适用场景：适用于需要精准细胞定位的研究（如免疫细胞浸润模式分析），但需注意其基因表达量约为FF样本的75%（图3A）
2. 冷冻样本优势：FF/SF在代谢相关基因（如CPT1A、ACSL1）表达量上分别较FFPE高18%和23%（P<0.01），适合研究能量代谢通路
3. 联合分析策略：建议采用"FFPE空间定位+FF代谢组学"的互补模式，既保持组织架构完整性，又获得高信噪比的基因表达数据

六、技术发展建议
1. 建立保存时效性标准：FFPE样本在-4℃环境下保存超过24个月，其TOP300基因表达稳定性下降15-20%
2. 开发冻存优化方案：采用速冻-解冻预处理（-80℃→37℃循环2次）可使FF样本的RNA完整性（dv200）从82提升至91
3. 多组学整合平台：建议整合空间转录组与质谱数据，构建CRC微环境多维度分析模型（已在本院CRC生物库中验证可行性）

本研究证实，FFPE样本在空间分辨率上具有不可替代性，而冷冻样本在基因表达丰度方面更具优势。通过建立标准化比较框架（包含12个ROI、36个AOI、3种保存方法），为后续开展大规模临床队列研究奠定了方法学基础。未来可结合单细胞测序数据，开发基于空间转录组-单细胞转录组联合分析（ST-SCTA）的新型研究范式，进一步提升CRC异质性解析能力。