黄铁矿驱动的氧化还原调节提高了微生物对呋喃类抑制剂的耐受性，从而增强了从木质纤维素水解物中生产氢气的效率

《Bioresource Technology》：Pyrite-driven redox modulation improves microbial tolerance to furan inhibitors in hydrogen production from lignocellulosic hydrolysates

暗发酵中黄铁矿通过加速抑制物转化提升产氢效率，其机制涉及Fe3+/Fe2+循环、EPS氧化还原组分调控及黄素分泌增强微生物抗逆性。

　　

孙浩宇|徐欣|李思佳|余磊|王权|陈荣平|尹可|郭光|孙旭|辛宇婷|徐文杰|吴功德

中国南京林业大学生物与环境学院环境工程系，南京 210037

引言

当前能源系统仍以化石燃料为主。这种依赖不仅难以满足不断增长的全球能源需求，还加剧了温室气体排放，与可持续发展目标相悖。在这种背景下，氢作为一种高能量密度、碳中性的能源载体，因其适合大规模应用而重新受到关注（Cheng等人，2023年）。 在生物制氢途径中，暗发酵因操作简单、条件温和以及能适应多种有机底物而具有特别的前景（Chen等人，2022年）。木质纤维素生物质是最丰富的可再生碳资源，已成为微生物生物燃料生产的理想原料（Deng等人，2020年；Nawaz等人，2022年）。然而，由于木质纤维素是一种由纤维素、半纤维素和木质素组成的难处理物质（Sun等人，2022年），因此需要预处理以释放可发酵的碳水化合物（Qasim等人，2021年）。酸处理和热化学处理可以有效降解生物质（Behera等人，2014年；Sivagurunathan等人，2017年），但同时也会产生糠醛（FUR）、5-羟甲基糠醛（5-HMF）和酚类等抑制剂（Jonsson等人，2013年；Ong等人，2019年）。这些抑制剂会显著抑制微生物代谢（Koopman等人，2010年）；例如，1克/升的糠醛可使暗发酵产生的氢气减少68%（Quemeneur等人，2012年）。由于糠醛的疏水性和反应性，它们能够自由穿过细胞膜并抑制依赖NADH的酶（Basak等人，2020年），从而消耗氢化酶催化产生氢气所需的还原剂。 传统的缓解策略（如活性炭吸附、碱性提取或基于溶剂的解毒）可以降低抑制剂浓度（Monlau等人，2014年），但往往会增加成本、复杂性并导致糖分损失。另一种方法是增强微生物在原位耐受和转化抑制剂的能力，同时保持可发酵碳的含量。最新研究表明，天然铁矿物可以通过促进Fe3?/Fe2?的氧化还原循环、加速细胞外电子转移（EET）、促进NADH再生以及引导代谢流向产氢途径（如丁酸途径）来增强暗发酵效果（Xu等人，2024年）。在矿物刺激下，细胞外聚合物物质（EPS）中的氧化还原活性增强以及氢化酶活性提高也有相关报道。这些发现表明，黄铁矿（FeS?）——一种含有活性氧化还原成分Fe和S的廉价硫化物矿物——可能有助于改善微生物的氧化还原平衡和整体耐受性。然而，黄铁矿是否能够特异性地增强微生物对糠醛和5-HMF的耐受性仍不明确。黄铁矿介导的氧化还原循环与细胞内NADH/NAD?平衡、EPS的氧化还原成分、黄素分泌以及微生物群落对糠醛压力的响应之间的相互作用尚未得到充分理解。 因此，本研究旨在：(i) 评估天然黄铁矿对玉米秸秆酶解液暗发酵产氢的影响；(ii) 确定黄铁矿如何调节关键系统指标，包括NADH/NAD?比例、细胞外黄素含量、抑制剂（糠醛和5-HMF）动态、微生物群落结构及电化学特性；(iii) 阐明黄铁矿增强微生物对糠醛衍生物耐受性和促进氢气生成的机制。通过结合发酵性能、氧化还原生物化学、群落分析和电化学诊断，我们发现黄铁矿能够激活内源性氧化还原反应，加速糠醛转化，从而提高微生物在木质纤维素向氢气转化过程中的适应性和产氢效率。

接种物和培养基

用于接种的厌氧颗粒污泥（AGS）来自中国南通一个处理烟草废水的上流式厌氧污泥床（UASB）。接种前，根据既定方案（Li等人，2024年），AGS在105°C下热处理30分钟以消除消耗氢气的微生物。 热处理后的厌氧颗粒污泥（HTAGS）以最终浓度2克/升直接接种到生物产氢培养基（BPM）中。

糠醛衍生物对产氢的影响

我们首先量化了糠醛衍生物——糠醛（FUR）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）对实际产氢量（P_act）的影响。在低总糠醛浓度（0.25克/升）下，对生物产氢的抑制作用很小：0.25克/升的糠醛仅使P_act减少了7%（图1A）；而0.125克/升的5-HMF加上0.125克/升的糠醛以及0.25克/升的5-HMF分别使P_act减少了6%和8.5%（图1B-C，p = 0.93和0.97）。在中间浓度下，抑制作用变得明显（图1D–F）。

结论

本研究阐明了糠醛和5-HMF如何抑制产氢微生物群落，并展示了黄铁矿如何通过多种相互关联的机制缓解这些影响。在糠醛压力下，产氢过程延迟了约12小时，糖的利用也受到严重抑制。添加黄铁矿后，糠醛转化速率提高了约33%，产氢高峰时间从约36小时提前到约24小时，累计产氢量恢复到约85毫升，与使用活化剂后的产氢量相当。

CRediT作者贡献声明

孙浩宇：撰写初稿、实验设计、数据管理。 徐欣：数据可视化、实验设计、数据管理。 李思佳：软件开发、实验设计。 余磊：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金申请。 王权：撰写、审稿与编辑、项目监督。 陈荣平：项目监督、资金申请。 尹可：撰写、审稿与编辑、项目监督。 郭光：方法学设计、实验设计、数据分析。 孙旭：数据可视化、数据管理。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益和个人关系：余磊报告称其研究得到了国家自然科学基金的支持。如果还有其他作者，他们声明自己没有其他可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢以下机构的财政支持：国家自然科学基金（项目编号：51778298；52200159）、江苏省高等学校自然科学基金（项目编号：25KJA610003）以及南京工业技术研究院科学研究基金（项目编号：YKJ202523）。