《Bioresource Technology》：Structure-guided engineering of P450BM3 as a cofactor-free peroxygenase for efficient biotransformation of cresol pollutants
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苯酚类污染物 cresol 的高效生物降解方法研究。工程化改造 CYP450BM3 酶蛋白，通过 V78F/F87A/T268D/A328F 四突变体构建 cofactor-free 过氧化酶系统，可在 25℃、pH7.0 下 2分钟内实现 o-/m-/p- cresol 转化率分别达 99.8%/98.3%/99.6%，催化效率达 56000-57464 M?1s?1。酶在模拟废水中活性保持 >98%，通过 UPLC-MS 分析证实以羟基化和氧化途径为主，结构解析揭示 78/87/268/328 位点协同调控 H2O2 活化及芳环底物结合。该成果为开发可持续废水处理技术提供新策略。
作者：杨亚丹、孟向敏、闫迪、杨立东、刘峰、徐家坤
单位：中国水产科学院黄海渔业研究所海洋养殖生物育种与可持续产品国家重点实验室、青岛海洋科学技术中心海洋药物与生物制品实验室，青岛266071，中国
摘要
甲酚是一种广泛使用的工业中间体，也是废水中的常见成分，由于其急性毒性和频繁出现而引发环境问题。在本研究中，我们改造了细胞色素P450BM3，使其能够在无需辅因子的情况下直接由H2O2驱动下作为过氧化物酶发挥作用。在268位引入天冬氨酸残基（T268D）后，该酶的过氧化物酶活性得到增强；同时，在78位、87位和328位的进一步替换改变了活性位点，从而改善了底物的结合能力和稳定性。最终得到的四重突变体V78F/F87A/T268D/A328F在温和条件下（25°C，pH 7.0）能够快速且几乎完全地转化o-、m-和p-甲酚，其催化效率分别为56000、48333和57464 M?1 s?1。该酶在模拟废水中仍保持超过98%的活性，显示出其在复杂环境中的稳健性。UPLC-MS分析证实，甲酚的转化主要通过羟基化和氧化途径进行，而非矿化作用。结构分析表明，78位、87位、268位和328位残基的协同排列增强了H2O2的活化效果，并促进了与芳香族底物的π–π相互作用。这些结果为基于过氧化物酶的酚类污染物生物转化提供了一个稳健且可推广的平台，为废水处理提供了一种可持续且高效的方法。
引言
甲酚包括o-甲酚、m-甲酚和p-甲酚三种异构体，是一类在化学工程、制药和材料制造领域具有广泛应用的重要有机化合物（Zhang等人，2023年）。这些化合物是合成多种化学品（如树脂、消毒剂和农用化学品）的关键中间体（Jaiswal等人，2023年）。由于甲酚在焦化、石油精炼和树脂生产过程中产生的废水中具有急性毒性且含量较高，因此被视为环境研究中的重要污染物（Yang等人，2022年；Chen等人，2024年；Bera等人，2019年；Muralidharan等人，2021年；Zheng等人，2019年）。美国环境保护署（USEPA）将甲酚列为优先污染物，因其生态毒性（Wang等人，2025年）。即使在低浓度（例如12 μg/L）下，甲酚也会导致慢性毒性效应，这凸显了亟需有效策略来减轻甲酚污染的必要性（Yu等人，2019年；Lamari等人，2016年）。
近年来，人们探索了多种处理甲酚污染的方法，如化学氧化（Yang等人，2018年；Han等人，2022年；Liu等人，2019年）、光降解（Zhang等人，2021年；Abdollahi等人，2012年）和吸附（Xu等人，2020年）。其中，芬顿氧化因其在化学氧化过程中的有效性而受到广泛关注。Flox等人发现，在最佳条件下，甲酚异构体的降解率可在120分钟内达到82%（Flox等人，2007年）。然而，这种方法需要精确控制反应条件（如极端pH值），实施起来较为复杂。此外，其他基于催化湿法过氧化的高级氧化过程（如使用Fe–CNT复合材料、Fe–PAN膜或双金属催化剂的系统）在处理甲酚及相关酚类污染物时通常需要相对苛刻的反应条件（Yang等人，2024年；Yang等人，2024年；Yang等人，2023年；Yang等人，2021年）。Mantilla等人利用镁铝氢滑石（Mg/Al LDH）在紫外光（4400 μW/cm2）下对p-甲酚进行光辅助降解，2.6小时后仅实现了50%的降解率（Mantilla等人，2011年）。这种方法存在反应时间长、降解效率低以及依赖光照强度和波长的问题。相比之下，生物催化（特别是酶催化的生物转化）因其环保性和温和的反应条件而受到越来越多的关注。Gonzalez-Coronel等人使用封装在LentiKats中的漆酶，在24小时内几乎完全去除了m-甲酚（Gonzalez-Coronel等人，2017年）。然而，较长的处理时间仍是一个显著限制。因此，探索环保且高效的方法来有效减轻甲酚污染至关重要。
细胞色素P450BM3（CYP102A1）是一种源自Bacillus megaterium的含血红素的单加氧酶，因其自给自足的电子转移系统和高催化效率而成为有前景的生物催化剂（Fan和Cong，2024年；Ariasu等人，2023年）。然而，其天然活性依赖于NAD(P)H作为辅因子，并且底物范围有限。最近的研究表明，P450BM3有可能作为过氧化物酶系统发挥作用（Zhang等人，2021年；Ma等人，2018年；Qin等人，2023年），该系统利用过氧化氢（H2O2）和双功能小分子的协同作用，实现了芳香胺的有效转化（Chen等人，2025年）、从吲哚合成靛蓝（Li等人，2023年；Kong等人，2022年）以及非甾体抗炎药物的生物转化（Yang等人，2024年）。Shoji等人发现，将268位的苏氨酸突变为谷氨酸可显著增强酶的H2O2驱动的过氧化物酶活性（Shoji等人，2016年）。这一修饰为进一步提升P450BM3的催化潜力提供了宝贵见解。在本研究中，我们报道了使用工程化的P450BM3-H2O2系统快速且无需辅因子地转化甲酚异构体的方法。通过定向突变引入过氧化物酶活性，我们实现了高效的H2O2驱动的氧化反应，从而无需NAD(P)H。这种方法不仅提高了P450BM3在大规模应用中的实用性，还加深了我们对血红素蛋白结构-功能关系的理解。改进后的系统具有广泛的底物耐受性和强的氧化性能，为可持续的化学合成和环境修复提供了实用平台。
化学试剂
o-甲酚、m-甲酚和p-甲酚购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。Q5定向突变试剂盒购自新英格兰生物实验室北京生物技术有限公司（中国北京）。质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司（美国诺克罗斯）。E. coli感受态细胞DH5α和BL21（DE3）购自北京生物医药基因技术有限公司（中国北京）。HPLC级甲醇购自...
构建P450BM3突变体
在本研究中，选择了四个残基（V78、F87、T268和A328），因为它们直接影响P450BM3中的H2O2活化和底物结合。T268D突变增强了I-螺旋弯曲处的质子传递环境，促进了H2O2的有效异裂（Ebrecht等人，2023年）。F87位（F87A/V）的突变减少了血红素上方的空间障碍，使甲酚更有效地接近催化中心（Li等人，2018年；Li等人，2001年）。A328位（A328F/Y）的变更...
结论
通过定向突变，我们构建了一系列P450BM3突变体，使其能够在无需辅助辅因子的情况下依赖H2O2进行催化，从而高效转化甲酚。其中，四重突变体V78F/F87A/T268D/A328F表现出最高的催化效率。在模拟废水中，该系统能够完全转化o-甲酚和p-甲酚，并将m-甲酚转化率达到98.3%，证明了其在废水处理中的实际应用价值。
作者贡献声明
杨亚丹：撰写初稿、数据整理、概念构思。
孟向敏：撰写、审稿与编辑。
闫迪：数据整理。
杨立东：数据验证。
刘峰：数据整理。
徐家坤：撰写、审稿与编辑、监督、资源提供、方法设计、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32171263）的支持。
