来自Rhodothermus marinus的位点选择性CE4酶以及在Bacillus cereus中展现出的多样化LmbE类催化活性

《Carbohydrate Research》：Site-selective CE4 enzyme from Rhodothermus marinus and diversified LmbE-Like catalysis in Bacillus cereus

新型羧肽酶4RmCBDA2510与LmbE-like酶BCLmbE1534协同拓展了壳聚糖寡糖的结构定制能力，前者实现链长依赖的位点选择性单去乙酰化，后者首次展现转酰化及新型酰化功能，为精准生物合成提供工具。

　　

作者：边俊、臧派、唐冉、魏灿、王亚青、刘莉、Josef Voglmeir

中国南京农业大学食品科学与技术学院糖组学与糖链生物工程研究中心（GGBRC），邮编210095

摘要

壳寡糖（COS）具有多种生物活性，这些活性强烈依赖于其N-乙酰化模式，因此人们开发了能够进行区域选择性去乙酰化的酶学方法。在本研究中，我们从Rhodothermus marinus中鉴定出一种名为RmCBDA2510的CE4去乙酰酶，该酶能够对COS进行严格、位点选择性和链长依赖性的单步去乙酰化。通过外切糖苷酶检测结合MALDI-TOF/TOF MS/MS分析，发现RmCBDA2510能够分别从壳二糖、壳三糖和壳四糖中生成AD（GlcNAc-GlcN）、ADA（GlcNAc-GlcN-GlcNAc）和AADA（GlcNAc-GlcNAc-GlcN-GlcNAc），显示出明显的内部位点偏好。该酶具有耐热性和碱性活性，定点突变实验表明Asp41位点是催化反应所必需的，这使得RmCBDA2510成为一种高效的选择性生物催化剂，可用于制备结构均匀的部分去乙酰化壳寡糖。

相比之下，来自Bacillus cereus的LmbE类似酶BCLmbE1534既能催化N-乙酰葡糖胺糖苷的去乙酰化，也能催化其与短链脂肪酸和生物素的酰基化/转酰基化反应。这是首次在LmbE家族中发现转酰基化反应，扩展了其催化功能。RmCBDA2510和BCLmbE1534共同为壳寡糖结构的修饰和氨基糖衍生物的多样化提供了互补的酶学平台，从而提升了碳水化合物活性去乙酰酶的合成应用范围。

引言

壳聚糖是自然界中含量第二丰富的多糖，是甲壳类动物外壳[1,2]、昆虫外骨骼[3]和真菌细胞壁[4,5]的关键结构成分。其水解产物壳寡糖（COS）具有多种生物活性，包括免疫调节[6]、抗菌[7,8]和抗氧化[9,10]作用，具有潜在的生物医学和农业应用价值。最新研究表明，具有精确聚合度和乙酰化模式的壳寡糖具有更特异的生物活性[11, [12], [13]，然而传统的化学或氧化水解方法会产生复杂的混合物，阻碍了结构-活性研究及其实际应用[14, [15], [16]。壳聚糖去乙酰酶（CDAs；EC 3.5.1.41）属于碳水化合物酯酶4（CE4）家族，能在温和条件下催化N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基上的N-乙酰基去除，从而生成具有定制取代模式的部分去乙酰化壳寡糖[13,17,18]。然而，目前可用于可溶性壳寡糖底物的高效CDAs种类仍然有限，限制了相关机制研究和生物技术应用的发展。Rhodothermus marinus是一种具有测序基因组的海洋嗜热细菌，编码多种稳定性高、半衰期长的碳水化合物活性酶[19, [20], [21]]。迄今为止，尚未有来自该菌的壳聚糖去乙酰酶被实验报道。因此，从R. marinus中筛选和鉴定新的CDAs可能为生产具有明确结构的壳寡糖提供有价值的生物催化剂，这些壳寡糖在生物医学和工业领域具有潜在应用价值。

来自Bacillus cereus的BCLmbE1534属于LmbE类似去乙酰酶家族，这类酶依赖锌离子，具有α/β折叠结构和保守的H-X-(8–12)-D催化基序，主要参与N-乙酰糖底物的去乙酰化[22, [23], [24]]。先前的研究表明，该酶具有广泛的底物特异性，能催化多种含GlcNAc的底物的去乙酰化，包括GlcNAc单体、聚合度为2–4的壳寡糖、GlcNAc-1-磷酸（GlcNAc-1P）、GlcNAc-6-磷酸（GlcNAc-6P）、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）以及尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）[25]。其最佳活性条件为pH 8.0和37°C，钴离子可增强其活性，而铜离子和锌离子则会抑制其活性[25]。尽管BCLmbE1534的部分特性已得到研究，但其其他催化活性（如GlcNAc糖苷的去乙酰化、酰基化和转酰基化）尚未进行评估。

在本研究中，我们从R. marinus中克隆并表达了新的壳聚糖去乙酰酶RmCBDA2510，并对其进行了生化表征。通过优化酸性水解条件，成功制备了聚合度明确的壳寡糖，为功能研究提供了均匀的底物。RmCBDA2510在低聚合度壳寡糖的去乙酰化过程中表现出高效性，而LmbE类似酶BCLmbE1534还显示出额外的催化能力，包括GlcNAc糖苷的去乙酰化以及酰基化和转酰基化反应。这些发现扩展了细菌去乙酰酶的功能范围，揭示了BCLmbE1534的新催化特性，并为制备具有生物医学和工业应用潜力的结构定制壳寡糖提供了实用策略。

细菌菌株、质粒和试剂

Bacillus cereus ATCC 14579和Rhodothermus marinus DSM 4252均来自德国微生物与细胞培养中心（DSMZ）。E. coli Mach1（Life Technologies）用于质粒扩增，E. coli BL21（DE3）（Invitrogen）用于蛋白质表达。编码BCLmbE1534的基因（705 bp，234个氨基酸；GenBank: ACK63858.1）由Genscript（南京）通过基于PCR的Accurate Synthesis技术合成，并使用NdeI和XhoI限制酶克隆到pET30a质粒中

RmCBDA2510的克隆与序列验证

通过同源性搜索，在Rhodothermus marinus（DSM 4252）基因组中鉴定出一个潜在的壳聚糖去乙酰酶基因，并将其命名为RmCBDA2510。该基因开放阅读框长度为936 bp，编码一个312个氨基酸的蛋白质。使用R. marinus基因组DNA进行PCR扩增，获得了预期大小的扩增产物（图1A）。该产物首先被连接到pGEM-T载体上，随后再克隆到pET-30a质粒中，构建了表达载体。Sanger测序确认插入片段与数据库序列完全一致，无错误

结论

本研究鉴定了来自Rhodothermus marinus的一种新的CE4家族去乙酰酶RmCBDA2510，并揭示了其独特的催化特性。通过外切糖苷酶检测和MALDI-TOF/TOF MS/MS结构分析，证明RmCBDA2510能够对壳寡糖进行严格位点选择性和链长依赖性的单步去乙酰化，从而精确生成AD、ADA和AADA。这种模式化的去乙酰化过程反映了该酶独特的内部位点偏好

作者声明

作者声明没有竞争性财务利益关系。

CRediT作者贡献声明

边俊：撰写初稿、数据整理。臧派：数据整理。唐冉：数据整理。魏灿：数据整理。王亚青：数据整理。刘莉：撰写、审稿与编辑、概念设计。Josef Voglmeir：撰写、审稿与编辑、可视化处理、数据分析、概念设计。

访问代码

RmCBDA2510（UniProt ID: D0MFA5），BCLmbE1534（UniProt ID: B7HHT8）。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）的资助，项目编号分别为31871793、31871754和W2432055。