RBP-J介导的对LINC00324的抑制通过SLC3A2在硅诱导的肺纤维化中促进铁死亡（ferroptosis）

《Cellular Signalling》：RBP-J-mediated suppression of LINC00324 promotes ferroptosis via SLC3A2 in silica-induced pulmonary fibrosis

硅肺病中RBP-J通过抑制LINC00324调控SLC3A2介导的铁依赖性脂质过氧化和上皮间质化，该通路在硅诱导肺纤维化中起关键作用。

　　

吴文龙|黄玲|方万清|王婉蓉|周思静|王然

安徽医科大学第一附属医院呼吸与重症医学系，中国合肥230022

摘要

背景

二氧化硅诱导的肺纤维化涉及上皮-间充质转化（EMT）和铁死亡（ferroptosis），但长链非编码RNA（lncRNAs）在这些过程中的调控作用仍不清楚。本研究探讨了LINC00324在铁死亡和EMT中的作用，这两者均有助于二氧化硅诱导的肺纤维化。

方法

A549和BEAS-2B细胞暴露于SiO?（100 μg/mL，24小时）。分子分析包括染色质免疫沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告基因检测、RNA免疫沉淀和功能拯救实验。体内验证实验中，C57BL/6小鼠通过气管内注射二氧化硅（50 mg/kg）和慢病毒介导的SLC3A2过表达（5 × 10^7 TU）进行处理，然后在第28天进行组织病理学/生化分析。

结果

二氧化硅暴露通过干扰RBP-J与LINC00324启动子区域的结合来抑制其转录。LINC00324的过表达减轻了二氧化硅诱导的铁死亡和EMT，而其敲低则加剧了这些过程。进一步研究表明，LINC00324通过SLC3A2在铁死亡和EMT中起调控作用。作为LINC00324上游的转录因子，RBP-J通过SLC3A2调节二氧化硅诱导的肺纤维化中的铁死亡和EMT。体内实验中，SLC3A2的过表达缓解了二氧化硅诱导的肺纤维化。

结论

总体而言，RBP-J/LINC00324/SLC3A2通路调控了矽肺中的铁死亡与EMT的耦合。RBP-J通过结合LINC00324的启动子区域并调节下游的SLC3A2来调控铁死亡和EMT。针对这一通路的治疗可能有助于对抗二氧化硅诱导的肺纤维化。

引言

矽肺是一种无法治愈且常导致残疾的职业性肺病，由吸入可吸入的结晶二氧化硅粉尘引起[1]。这种暴露会引发持续的肺部炎症，并最终导致进行性纤维化，其特征是细胞外基质过度沉积、肺泡结构破坏以及肺功能不可逆地丧失。尽管已有大量研究，但目前仍缺乏有效的治疗策略来阻止或逆转二氧化硅诱导的肺纤维化，这突显了深入理解疾病进展的分子机制的必要性。

最新证据表明，铁死亡（一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的受调控细胞死亡形式）在多种器官的纤维化发病机制中起着关键作用[[2], [3], [4], [5], [6], [7]]。铁死亡在多种病理过程中的作用日益受到重视，包括癌症发生、神经退行性疾病、缺血-再灌注损伤以及纤维化疾病。在这些情况下，细胞铁代谢、抗氧化防御系统和脂质过氧化的失调会导致致命的脂质活性氧物种积累，最终引发铁死亡并导致组织损伤和器官功能障碍[[8], [9], [10]]。铁死亡受到多种途径的调控，其中半胱氨酸/谷氨酸转运系统Xc^-起着核心作用[11]。SLC3A2（溶质载体家族3成员2；CD98hc）是Xc^-系统的重链亚基，对于稳定转运复合物在质膜上的定位以及促进半胱氨酸的摄取至关重要[[11], [12], [13]]。这一过程对谷胱甘肽的合成和维持细胞氧化还原平衡至关重要。SLC3A2表达的降低会通过破坏半胱氨酸转运、限制谷胱甘肽的产生以及削弱抗氧化防御机制，直接使细胞易受铁死亡的影响[14]。然而，在二氧化硅诱导的肺纤维化背景下，控制SLC3A2表达和铁死亡敏感性的具体调控途径尚未完全阐明。

长链非编码RNA（lncRNAs）已被证明在多种生物过程和疾病状态中起关键调控作用，包括纤维化和细胞应激反应[3,4,15]。LINC00324是一种相对未被充分研究的lncRNA，可能是调节与纤维化进展相关的细胞通路的潜在候选因子[5]。其在肺纤维化中的具体作用，尤其是其与关键信号通路的相互作用，值得进一步研究。

重组信号结合蛋白免疫球蛋白κ J区（RBP-J）是一种重要的转录因子，主要作为经典Notch信号通路的核心中介，对细胞的命运决定（包括增殖、分化和凋亡/存活反应）有显著影响[6]。在多种纤维化疾病中观察到RBP-J/Notch信号通路的失调[16]。然而，RBP-J与矽肺中铁死亡或特定lncRNAs调控之间的直接联系尚未被探索。

总体而言，我们的结果表明，RBP-J介导的lncRNA LINC00324的转录抑制通过下调SLC3A2促进了矽肺的发病机制。我们发现二氧化硅暴露导致RBP-J活性降低，从而抑制了LINC00324的表达。此外，LINC00324的抑制减少了SLC3A2的表达，进而促进了二氧化硅诱导的铁死亡，并最终导致了EMT和肺纤维化。

实验部分

细胞培养和处理

人类支气管上皮细胞（BEAS-2B）和肺泡上皮细胞（A549）从美国典型培养 kolec tion（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯）获得，并在含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中于37°C、5% CO?环境下培养。细胞分别用DMSO作为对照组，或用不同浓度的二氧化硅（Sigma，718483，d = 12 nm，mp > 1600°C）处理（0、50、100、150和200 μg/mL），或用100 μM去铁胺（DFO，一种铁死亡抑制剂）处理。

DFO在体外抑制SiO?诱导的铁死亡和EMT

为了建立最佳的体外SiO?诱导模型，使用CCK-8检测方法评估了不同浓度和暴露时间下SiO?对A549和BEAS-2B细胞的毒性。剂量-时间反应分析显示，100 μg/mL的SiO?处理24小时在两种细胞类型中产生了最佳的诱导效果（见图1A,B）。因此选择这一条件进行后续实验，以研究铁死亡在EMT中的作用。同时评估了铁死亡的生物标志物。

讨论

二氧化硅暴露是肺纤维化发展的一个已知风险因素，肺纤维化是一种慢性进行性肺病，其特征是细胞外基质成分过度积累、上皮-间充质转化和成纤维细胞增殖[19,20]。我们的研究为揭示二氧化硅诱导的肺纤维化涉及的复杂分子机制提供了新的证据，特别关注了铁死亡的作用。

结论

总之，我们的发现证实了RBP-J/LINC00324/SLC3A2通路在调控二氧化硅诱导的肺纤维化中的铁死亡和EMT中的关键作用。这项研究不仅加深了我们对矽肺发病机制的理解，还确定了这种无法治愈的肺病的潜在治疗靶点。

CRediT作者贡献声明

吴文龙：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，方法学研究，数据管理。黄玲：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，方法学研究，正式数据分析。方万清：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，正式数据分析。周思静：结果验证，项目监督，资源协调，项目管理，概念构思。王然：结果验证，项目监督，资源协调，项目管理，资金支持

资助

本研究得到了安徽医科大学国家级一流本科专业建设项目（2020SJJXSFK1364）、安徽医科大学青年江淮名医培训项目、合肥第七轮重点医学学科建设项目（职业医学）、安徽健康研究计划（AHWJ2023A30009）以及合肥健康应用医学研究项目的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。

致谢

我们衷心感谢安徽医科大学提供的实验场地和平台。