CARF-HAD磷酸酶效应器在III-A型CRISPR-Cas免疫应答中的核苷酸耗竭机制

《Nucleic Acids Research》：CARF-HAD phosphatase effectors provide immunity during the type III-A CRISPR–Cas response

本研究揭示了CRISPR-Cas系统新型防御机制：研究人员发现含有HAD磷酸酶结构域的CARF效应器（Chp）在III-A型CRISPR-Cas免疫中通过cA4激活后，能够特异性水解ATP/dATP/IMP等核苷酸，导致细菌生长停滞并有效防御噬菌体感染。该发现拓展了CARF效应器的分子作用谱，为原核生物抗病毒策略提供了新见解。

　　

在微生物与病毒永无休止的军备竞赛中，原核生物进化出了精妙的CRISPR-Cas系统作为适应性免疫武器。其中III型CRISPR-Cas系统通过Cas10复合物感知入侵者RNA后，会启动三重防御机制：切割靶RNA、降解单链DNA以及合成环状寡腺苷酸（cOA）第二信使。这些cOA分子如同烽火信号，能激活各类CARF效应器，通过干扰宿主代谢来阻断病毒增殖。然而，目前已知的CARF效应器作用机制仍显局限，能否发现具有新型酶活性的效应器成为领域内亟待探索的方向。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，Marraffini团队将目光投向了两个神秘的CRISPR关联基因——它们编码的蛋白同时包含HAD磷酸酶结构域、跨膜螺旋和CARF结构域。研究人员将这些新型效应器命名为Chp（CRISPR-associated HAD phosphatase），并系统阐明了它们在III-A型CRISPR-Cas免疫中的独特作用机制。

研究采用的主要技术方法包括：蛋白质定位分析（细胞分级与Western blotting）、体内外酶活检测（HPLC与质谱联用分析核苷酸水平）、热迁移实验（测定cOA结合特性）、噬菌斑实验（评估抗病毒能力）以及AlphaFold3结构预测。

BbChp减少ATP和IMP水平以在III-A型CRISPR-Cas应答中介导细胞毒性

研究人员首先通过AlphaFold3预测发现BbChp和PsChp能通过CARF结构域形成二聚体。细胞分级实验表明这两种蛋白主要定位于细菌膜上。当在金黄色葡萄球菌中诱导III型CRISPR系统产生cOA时，表达BbChp的菌株出现明显生长停滞。液相色谱-质谱联用分析显示，BbChp激活后细胞内ATP和IMP水平显著下降，提示其可能通过水解核苷酸发挥作用。

BbChp和PsChp的CARF结构域结合cA4

热迁移实验证实两种蛋白的CARF结构域特异性结合cA4（解离常数K_d=273 nM），而对cA3和cA6无响应。高效液相色谱分析排除了它们具有环状核酸酶活性的可能性。

Chp效应器使ATP和dATP去磷酸化

体外酶活实验显示PsChp-HAD结构域可水解dATP（38%）、ATP（17%）和IMP（22%），BbChp-HAD则主要作用于dATP（14%）和ATP（19%）。该活性依赖Mn²⁺或Mg²⁺，且对磷酸化糖类或维生素无作用，表明其底物特异性偏向核苷酸。

在HAD磷酸酶中发现的保守残基对BbChp毒性非必需

尽管序列比对发现Chp含有HAD磷酸酶典型的保守基序（I-IV），但将这些保守残基（D8、D10、K118等）突变为丙氨酸后，仅部分降低而非完全消除体内毒性和体外酶活，提示即使微弱的水解活性也足以引发防御反应。

BbChp和PsChp提供抗噬菌体防御

当Cas10的核酸酶活性失效时，BbChp仍能通过生长停滞效应防御晚期表达靶标的噬菌体（MOI=1）。荧光显微镜观察显示感染细胞停止分裂而未感染细胞继续增殖，证实Chp通过中止病毒生命周期来保护群体。

研究结论表明，CARF-HAD磷酸酶效应器代表了一类新型抗病毒武器，其通过膜定位特性与核苷酸水解功能的独特组合，扩展了III型CRISPR-Cas系统的防御策略。这种通过耗竭核苷酸池来破坏病毒复制的机制，与已知的核酸酶、膜去极化或NAD⁺水解等效应器形成功能互补，彰显了CRISPR免疫系统的进化可塑性。该发现不仅深化了对原核生物抗病毒机制的理解，也为开发新型抗菌策略提供了分子基础。