基于多重PCR的两种同域螟虫快速鉴定新方法及其在害虫综合治理中的应用

《Journal of Insect Science》：Multiplex PCR-based identification of two sympatric stem borer species, Sesamia cretica and Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae)

本刊推荐：为解决伊朗玉米和甘蔗田中Sesamia cretica和S. nonagrioides两种形态相似螟虫幼虫难以准确鉴定的问题，研究人员开展了基于COI基因的多重PCR鉴定技术开发。研究成功设计出特异性引物，可同步扩增出367 bp（S. cretica）和438 bp（S. nonagrioides）的条带，测序验证特异性达99%以上。该方法为害虫早期监测和精准防控提供了可靠工具，对减少农药滥用具有重要意义。

　　

在伊朗南部的玉米田和甘蔗田中，一种看不见的威胁正在悄然蔓延——茎秆螟虫。这些属于Sesamia属的害虫幼虫钻入作物茎秆内部，破坏维管组织，导致作物减产甚至绝收。更棘手的是，两种主要害虫Sesamia cretica和Sesamia nonagrioides的幼虫阶段形态极为相似，仅凭肉眼难以区分，这给精准防控带来了巨大挑战。

传统的鉴定方法需要将幼虫饲养至成虫阶段，通过观察翅膀花纹和生殖器特征才能确定种类，整个过程耗时耗力。而错误的鉴定可能导致农药的滥用或漏防，不仅增加生产成本，还会对环境造成负面影响。随着综合害虫治理理念的推广，开发快速、准确的早期鉴定技术显得尤为迫切。

在这一背景下，洛雷斯坦大学的研究团队将目光投向了分子生物学技术。多重PCR作为一种能够同时检测多个靶标的技术，特别适合用于相近物种的快速鉴别。研究团队设想：能否找到两个物种独特的基因标记，通过一次PCR反应就能明确区分它们？

研究的第一步是样本收集。团队在2025年生长季节从伊朗胡齐斯坦省的玉米和甘蔗田中采集了50个螟虫幼虫样本。为了避免肠道内容物对DNA提取的干扰，研究人员创新性地使用幼虫头壳进行DNA提取，采用CTAB法获得高质量DNA。

引物设计是研究的关键环节。团队从GenBank下载了73条COI基因序列（30条S. cretica和43条S. nonagrioides），通过多序列比对找出物种特异的变异区域。最终设计出两对特异性引物：SC-F/SR-R针对S. cretica，SN-F/SR-R针对S. nonagrioides。生物信息学分析显示，这些引物只与目标物种匹配，与其他近缘种存在错配，保证了检测的特异性。

优化后的多重PCR反应体系在50°C退火温度下，能同时扩增出367 bp（S. cretica）和438 bp（S. nonagrioides）的特异性条带。琼脂糖凝胶电泳结果显示，两种条带区分明显，无交叉反应，阴性对照无扩增产物，证明了方法的可靠性。

分子鉴定与形态验证

研究人员对PCR产物进行测序验证，结果显示与目标物种的相似度达到99%以上。同时，通过幼虫头壳颜色差异（S. cretica较浅，S. nonagrioides较深）以及实验室饲养获得的成虫翅膀花纹和生殖器特征，双重验证了分子鉴定结果的准确性。这种分子与形态学相结合的方法，确保了鉴定结果的可靠性。

系统发育与单倍型分析

基于COI基因序列的系统发育分析清晰地将两个物种分开，各分支的支持率均较高。单倍型网络分析揭示了有趣的遗传结构差异：S. cretica呈现紧凑的单倍型网络，表明其遗传多样性较低；而S. nonagrioides则显示出更为分散的模式，反映了更高的遗传多样性。这种差异可能与两个物种的种群历史、基因流动水平或环境适应能力有关。

技术方法概述

本研究主要采用样本采集（伊朗胡齐斯坦省田间幼虫）、DNA提取（CTAB法从头壳提取）、多重PCR引物设计（基于COI基因变异区）、PCR优化（退火温度50°C）和电泳检测（1.5%琼脂糖凝胶）等技术，结合测序验证和形态学比对，建立了一套完整的鉴定体系。

研究结论与意义

该研究成功开发了一种快速、准确的多重PCR鉴定方法，能够在3小时内完成S. cretica和S. nonagrioides的鉴别，解决了幼虫阶段形态鉴定难题。这种方法不仅提高了鉴定效率，降低了成本，更重要的是为害虫的早期监测和精准防控提供了技术支撑。

在害虫综合治理框架下，准确识别害虫种类是实现靶向防治的前提。该方法的应用有望减少不必要的农药使用，降低环境压力，同时提高防治效果。特别是在两种害虫同域分布的伊朗南部地区，这一技术将为农民和植保工作者提供实用的诊断工具。

虽然本研究展示了良好的应用前景，但作者也指出，需要在更广泛的地理区域进行验证，以评估该方法在不同种群中的适用性。未来研究可以考虑整合更多遗传标记或采用数字PCR等先进技术，进一步提升检测的灵敏度和准确性。

这项发表于《Journal of Insect Science》的研究，不仅为Sesamia螟虫的鉴定提供了实用工具，也为其他农业害虫的分子诊断技术开发提供了可借鉴的思路。随着分子技术的不断进步，精准农业和可持续害虫管理将迎来新的发展机遇。