枯草芽孢杆菌中嗜热地芽孢杆菌α-淀粉酶的高效胞外生产：一种多层级协同优化策略

《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》：Synergistic strategies for high production of Geobacillus stearothermophilus α-amylase in Bacillus subtilis

本研究针对嗜热地芽孢杆菌α-淀粉酶（AmyS）酶活低、限制工业应用的问题，在GRAS宿主枯草芽孢杆菌中，通过定向进化（获得三重突变体AmySM）、信号肽（SPykwD）、启动子（PgsiB）和核糖体结合位点（RBS7）的多层级优化，显著提升了AmyS的催化活性和胞外产量。最终工程菌在5-L发酵罐中酶活达到1244.17 U/mL，为工业规模的高价值蛋白生产提供了高效策略。

　　

在工业生物技术领域，α-淀粉酶（α-amylase）扮演着至关重要的角色，它能够高效水解淀粉分子中的α-1,4-糖苷键，广泛应用于食品、纺织、洗涤剂和生物燃料等行业。其中，来源于嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的α-淀粉酶（AmyS）因其卓越的热稳定性和催化效率而备受青睐。然而，尽管优势明显，其固有的较低酶活性（例如，本研究初始菌株产量仅为44.36 ± 2.02 U/mL）却成为制约其大规模工业应用的瓶颈。同时，寻找安全、高效的生产宿主也是实现其价值的关键。大肠杆菌等传统表达系统可能存在内毒素问题，而毕赤酵母系统产量有时不尽人意。因此，开发一种既能保证安全性，又能实现高产量的表达系统迫在眉睫。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种通常被认为是安全的（GRAS, Generally Recognized As Safe）微生物，凭借其强大的蛋白质分泌能力、清晰的遗传背景和成熟的发酵工艺，被视为生产工业酶制剂的理想宿主。尽管已有多种策略用于提升枯草芽孢杆菌的异源蛋白表达水平，例如信号肽筛选、启动子工程和翻译优化等，但将嗜热地芽孢杆菌的amyS基因在该宿主中进行高效表达，并系统性地进行多层级工程改造的研究尚属空白。由Rao Deming、Yang Jiangke等研究人员完成并发表于《Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology》的这项研究，正是为了填补这一空白。他们旨在通过一套综合性的协同工程策略，显著提升AmyS在枯草芽孢杆菌中的胞外产量，从而为工业规模生产这种重要的酶奠定基础。

为达成目标，研究人员运用了几项关键的技术方法。首先，他们采用易错PCR（error-prone PCR）技术对amyS基因进行随机突变，构建突变文库，并通过高通量筛选获得酶活性提高的突变体。其次，他们利用商业化的信号肽文库，在96孔板水平进行高通量筛选，以鉴定能最优介导AmyS胞外分泌的信号肽。再者，通过替换不同强度的组成型或诱导型启动子（如PgsiB、PaprE等）来优化转录水平。最后，基于理性设计，对翻译起始的关键元件——核糖体结合位点（RBS）进行系统优化，以提升目标蛋白的合成效率。研究中所用的主要宿主为蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌WB600，以减少胞外蛋白的降解。所有发酵实验均在摇瓶和5-L生物反应器两个尺度进行，以评估工程菌株的性能。

重组AmyS在枯草芽孢杆菌WB600中的表达

研究首先成功地将野生型amyS基因导入枯草芽孢杆菌WB600中，构建了初始工程菌株WBSW。摇瓶发酵实验证实，该菌株能够将具有预期分子量（约55 kDa）的AmyS分泌到胞外，酶活性达到44.36 ± 2.02 U/mL。这初步验证了使用枯草芽孢杆菌作为宿主表达AmyS的可行性。

通过高通量筛选获得活性增强的AmyS突变体

为了改善AmyS本身的催化性能，研究人员通过易错PCR构建了包含1500个变异体的突变库。经过高通量筛选，他们鉴定出一个三重突变体（T151A/K178E/T458A），并将其命名为AmySM。表达AmySM的菌株WBSM在摇瓶发酵中显示出51.34 ± 1.11 U/mL的酶活，相较于初始菌株WBSW提高了17.67%。进一步的酶学性质表征表明，AmySM在维持野生酶最适温度和pH的同时，比酶活提升了6.37%。为探究突变体活性增强的分子机制，研究人员进行了同源建模和分子动力学模拟。结构分析显示，突变位点位于酶的B结构域（T151A, K178E）和C结构域（T458A）。其中，K178E突变破坏了一个原有的盐桥，导致局部β-折叠转变为更灵活的环状结构。分子动力学模拟结果支持了这一发现，表明突变体B结构域的柔性增加，使得附近的芳香族残基（W140和W167）与底物麦芽七糖（maltoheptaose）的π-π堆叠相互作用增强，线性相互作用能分析也证实突变体与底物的结合自由能降低，从而解释了其催化效率提升的原因。

筛选信号肽以增强AmySM酶活性

高效的胞外分泌是实现高产的关键。研究人员从一个包含173个枯草芽孢杆菌天然信号肽的文库中进行了大规模筛选，初步选出11个能提高AmySM分泌的候选者。随后，将这些候选信号肽替换到表达载体中，并在WB600宿主中进行验证。摇瓶发酵结果显示，使用信号肽SPykwD的菌株WBYkwD效果最佳，其胞外酶活达到65.23 ± 2.33 U/mL，比使用原始信号肽SPaprE的对照菌株提高了29.32%。信号肽SPnprE也表现出较好的效果（提高20.04%）。淀粉平板实验形成的透明水解圈大小与酶活数据一致。这表明信号肽SPykwD对介导AmySM的高效分泌具有独特优势。

优化启动子以增强AmySM酶活性

在转录水平上，研究人员测试了六个不同的强启动子（PtufA, PgsiB, PaprE, PnprE, PgapA, PsodA）以替代原始的PamyQ启动子。结果表明，采用PgsiB启动子的菌株WBPgsiB效果最显著，酶活达到89.54 ± 2.95 U/mL，比对照菌株（使用SPykwD但保留PamyQ启动子）提高了37.61%。PaprE启动子也能带来34.16%的提升。所有工程菌株的生物量没有显著差异，说明酶活提升源于启动子强度的差异而非生长状况。淀粉平板实验再次验证了这一结果。

调控RBS以增强AmySM酶活性

最后，研究团队对翻译起始的关键控制元件——核糖体结合位点进行了理性设计优化。他们将原始RBS0替换为7个不同设计的RBS变体（RBS1-RBS7）。摇瓶发酵评估发现，含有RBS7的菌株WBRBS7表现最为突出，其胞外酶活高达134.02 ± 3.54 U/mL，比优化前（使用PgsiB启动子和RBS0）的菌株WBPgsiB进一步提高了48.83%。而其他一些RBS变体反而导致表达量下降，凸显了RBS序列优化的特异性和重要性。菌株生长状况依旧相似，淀粉平板水解圈大小与酶活数据吻合。至此，通过定向进化（获得AmySM）、信号肽优化（SPykwD）、启动子强化（PgsiB）和RBS优化（RBS7）这四步逐级叠加的工程策略，最终构建的工程菌株WBRBS7在摇瓶水平的总酶活提升达到了3.02倍。

在5-L发酵罐中评估重组WBRBS7的胞外α-淀粉酶活性

为了验证该多层级优化策略在规模化发酵中的效果，研究人员将最优工程菌株WBRBS7在5-L生物反应器中进行高细胞密度发酵。在严格控制溶解氧、pH和补料策略的条件下，该菌株在发酵72小时时达到了最高胞外酶活，为1244.17 ± 48.66 U/mL，这比初始菌株WBSW在发酵罐中的最高产量（437.81 ± 12.67 U/mL）提高了2.84倍，同时也是摇瓶发酵水平的9.28倍。SDS-PAGE分析显示，发酵后期（72小时）胞外培养基中AmySM蛋白积累量最大，证实了优化后的AmySM在枯草芽孢杆菌中实现了高效分泌。最终菌体密度（OD₆₀₀）达到105.94，AmySM的比活为585.60 ± 10.18 U/mg。

综上所述，本研究成功地通过一套包含定向进化、信号肽筛选、启动子替换和RBS优化的协同策略，极大地提升了嗜热地芽孢杆菌α-淀粉酶突变体AmySM在安全宿主枯草芽孢杆菌WB600中的胞外产量。最终获得的工程菌株WBRBS7无论在摇瓶规模还是5-L发酵罐规模均表现出优异的性能，酶活提升显著。这项研究不仅为AmyS的工业化生产提供了一条高效、安全的路径，更重要的是，其所展示的多层级、模块化的基因工程优化框架具有高度的通用性和指导意义。该策略可以灵活地应用于其他具有重要价值的异源蛋白在枯草芽孢杆菌或其他微生物宿主中的高效表达，从而推动工业生物制造技术的发展。研究者在讨论部分也指出，未来可以借助定量蛋白质组学等工具进一步揭示SPykwD等元件介导高效分泌的深层分子机制，为理性设计提供更多理论依据。