4-氨基哌啶类抗SARS-CoV-2病毒化合物的发现、构效关系及作用机制研究

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery and SAR studies of antiviral 4-aminopiperidine derivatives active against SARS-CoV-2

本刊推荐一篇关于抗病毒药物发现的重要研究。作者团队通过对CSIC化合物库进行筛选，发现了两类具有抗SARS-CoV-2活性的4-氨基哌啶衍生物（EC90< 2 μM）。通过系统的药物化学优化（SAR），获得了选择性指数（SI）显著提升（13至>28）的先导化合物。研究揭示了此类阳离子两亲性化合物（pKa> 7.6/9）可能通过诱导磷脂沉积症（PL）干扰宿主细胞磷脂代谢，从而发挥其抗冠状病毒（SARS-CoV-2, HCoV-229E）作用，为开发靶向宿主的新型抗病毒策略提供了新思路。

　　

摘要

本研究始于对CSIC化学库进行筛选，以发现新的抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）化合物。在发现的几个活性化合物家族中，基于1-苯乙氨基哌啶骨架的4-氨基哌啶衍生物（即A系列和B系列）显示出良好的前景。通过构效关系（SAR）研究，发现了新的衍生物（例如化合物20、33c、38c、41c、59a和72），其抗病毒效力相较于早期先导化合物（图1）提高了高达10倍，并改善了治疗指数。然而，与对照药物瑞德西韦（Remdesivir）相比，所选先导化合物（20、33c和46c）在EC₉₀和2×EC₉₀浓度下抑制病毒传播的能力有限。这种行为可能与其作用机制有关，该机制涉及宿主细胞的磷脂代谢，正如化合物20、33c和42c在A549-hACE2细胞中诱导磷脂沉积症（PL）所证明的那样。

引言

在过去的二十年中，由三种高致病性人类β冠状病毒（CoV）引起的不同严重急性呼吸道感染导致了三次大流行。这些病毒是冠状病毒科的有包膜、正义单链RNA病毒。在最近的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行期间，几种成功的疫苗获得批准，使得疫情得到控制，并降低了SARS-CoV-2感染导致的死亡率。

迄今为止，只有少数小分子抗病毒药物被批准用于COVID-19治疗。然而，针对SARS-CoV-2的化疗手段仍然有限，特别是考虑到当前针对病毒酶的抗病毒药物很容易导致耐药变体的出现。因此，需要新的抗病毒先导化合物，最好是针对保守的病毒和/或宿主靶点的广谱抗病毒药物，以改进针对冠状病毒的化疗方法。

作为这项计划的一部分，对来自西班牙最高科学研究理事会（CSIC）化学库的数百种化合物进行了针对冠状病毒的筛选，从而鉴定出多个具有抗SARS-CoV-2病毒活性的化合物家族。本文报道了基于1-苯乙氨基哌啶骨架的两个系列化合物的发现和SAR研究，这些化合物通过一种明显的非病毒依赖性机制表现出抗SARS-CoV-2活性。

早期SAR结果

对超过200种化合物的初步筛选鉴定出几种能够保护Vero E6细胞单层免受SARS-CoV-2细胞病变效应影响的先导化合物，其估计EC₅₀值在低微摩尔范围，治疗指数（TI）大于4。基于这些结果，选择了两个先导化合物（IQM_ANP_L-10G08和IQM_ANP_L14）进行进一步研究（图1）。

为了确认先导化合物干扰病毒复制/传播的能力，我们在人肺细胞系A549-hACE2中直接测量了感染期间细胞内病毒抗原的积累。该实验证实先导化合物IQM-ANP-L-10G08（A系列）和IQM-ANP-L-14（B系列）对SARS-CoV-2具有抗病毒活性，EC₅₀值分别为27.3和11.7 μM。因此，启动了一项药物化学项目来阐明A系列和B系列化合物的SAR。

结果与讨论

1. A系列类似物的SAR结果

1.1. 分子左侧（R¹）和桥连部分（R²）

首先，我们研究了先导化合物IQM-ANP-L-10G08（1a）左侧N-R²取代基（桥连部分）以及连接苯环（R¹）和1-哌啶骨架的烷烃链中亚甲基单元数量（n = 1, 2）的影响（表1）。新化合物首先在Vero E6细胞的细胞单层SARS-CoV-2保护试验中进行评估；然后，活性化合物在A594-hACE2细胞试验中进行测试（表1）。R¹中苯基和哌啶-4-氨基基团之间的亚甲基单元数量（即n = 1, 2）对于最佳抗病毒活性似乎很重要。苯乙基优于苄基，这与R²的性质无关。将哌啶环改为环己基环（12a, 13a）也对Vero E6细胞的保护试验活性不利，表明该位置的氮原子很重要。然而，在A594-hACE2细胞试验中，环己基苯7（EC₉₀= 36.6 μM）和叔丁基环己烷8（EC₉₀= 11.3 μM）衍生物显示出微摩尔范围的抗病毒活性。在这种情况下，游离仲氨基基团（R²= H）的存在似乎补偿了哌啶环叔氨基基团的缺失。因此，分子该部分（左侧和/或桥连部分）中可电离N原子的存在对于抗病毒活性至关重要。含有不可电离的氨基甲酸酯连接（即Cbz基团）的化合物9（EC₉₀> 50 μM）的低活性与这些观察结果一致。

根据这些SAR研究，分子左侧存在叔氨基基团（X = N）和烷基（R²= CH₃）或烷基酰胺桥连（R₂= COEt, COMe）似乎与苯乙基衍生物增强的抗病毒活性相关。此外，R²中丙酰胺取代基的存在似乎减轻了化合物1a（CC₅₀> 50）与其未取代类似物5（CC₅₀= 12.7 μM）相比的细胞毒性。基于这些数据，我们决定探索分子1a的右侧部分。

1.2. 分子右侧（R³）

由于先导化合物1a在R³处有一个庞大的叔丁氧羰基（Boc）基团，我们决定测试该位置相关的烷基（20–25）、酰胺（26–28）和芳基酰胺（29, 30）基团以探索分子的这一部分（方案2, 表2）。

用烷基（20）或环烷基（21–23）基团替换R³中的Boc基团（1a, EC₉₀= 47.0 μM）使抗SARS-CoV-2活性提高了约6.7至20倍，EC₉₀值≤ 7.0 μM且TI >4.2（表2）。苄基取代基（24和25：EC₉₀= 8.6和6.9 μM）也保持了抗病毒活性，尽管它们毒性稍大（TI<2.5）。在该系列中，环烷基基团的大小似乎对抗病毒活性（^tBu > c-hexyl > c-pentyl ≈ c-propyl）和化合物的细胞毒性有影响。引入烷基酰胺（26, EC₉₀= 47.7 μM; 27, EC₉₀= 29.7 μM）或芳基酰胺取代基（29, 30）对Boc基团的改善很小，EC₉₀值相似。

提供活性最大提高（17倍）和治疗指数最高（20, EC₉₀= 2.7 μM, TI = 7.9）的2,2-二甲基丙烷R³基团被选作进一步研究。化合物20被认为是一个良好的候选物，因为它在无毒浓度下显示出明确的抗病毒活性。

1.3. A系列SAR优化：R¹取代基的影响

获得新的先导化合物（20, R²= COEt, R³= CH₂^tBu）后，我们决定进一步研究分子的左侧。特别是，我们感兴趣的是了解R¹中不同苯环取代基对活性的影响。

将20-HCl（EC₉₀= 1.7 μM）的苯环改为萘环（41c, EC₉₀= 1.8 μM）保留了抗病毒活性。将苯环和4-氨基哌啶骨架之间的间隔基长度从乙基（20）增加到丙基（46c）不利于抗病毒活性（EC₉₀= 9.8 μM, TI = 2.5）。引入噻吩-2-基（32c）、丙烷-1,1-二基二苯（43c）、2-乙基-5-苯基呋喃基团（44c）或苄氧羰基（Cbz）基团（47）也对活性不利并促进了细胞毒性。相反，4-吗啉代（42c, EC₉₀= 5.3 μM, TI > 9.5）和4-甲氧基苯环（33c, EC₉₀= 1.6 μM, TI = 13.5）保持了强大的抗病毒活性和与20相同范围内的低细胞毒性。苯环对位上的其他取代基具有不同的效果：溴原子（39c, EC₉₀= 2.0 μM）以毒性为代价（TI = 5.1）保持了与20相同的抗病毒活性，而4-氟苯类似物40c的活性比20低三倍，细胞毒性谱相似（EC₉₀= 9.8 μM, CC