基于S1蛋白的双抗原夹心ELISA技术建立及其在猪δ冠状病毒跨物种抗体检测中的应用

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Double-antigen sandwich ELISA based on S1 for cross-species detection of Porcine deltacoronavirus antibodies

本研究针对猪δ冠状病毒(PDCoV)跨物种传播风险及缺乏高效血清学检测工具的问题，开发了基于S1蛋白的双抗原夹心ELISA(DAgS-ELISA)方法。该技术表现出92.86%的灵敏度和99.11%的特异性，与中和抗体滴度显著相关(r=0.865)，为PDCoV流行病学监测和疫苗评估提供了重要技术支撑。

　　

在当今全球养殖业面临严峻挑战的背景下，新发传染病如同悬在畜牧业头上的达摩克利斯之剑。其中，猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)自2012年首次发现以来，已在全球多个养猪国家造成严重经济损失。这种冠状病毒主要感染仔猪肠道上皮细胞，引起急性腹泻、呕吐和脱水等症状，对新生仔猪的致死率高达30%-80%。更令人担忧的是，越来越多的证据表明PDCoV具备跨物种传播能力，不仅能够感染牛、鸡等经济动物，还能侵入犬类细胞，甚至在2021年海地儿童的血清中检测到病毒核酸，敲响了人畜共患病的警钟。

面对这一威胁，传统的血清学检测方法存在明显局限性。间接免疫荧光 assay(IFA)和病毒中和试验(VNT)虽然准确，但操作繁琐、耗时较长，且需要专业实验室条件。而常规的酶联免疫吸附 assay(ELISA)多采用核衣壳蛋白作为靶抗原，虽然灵敏度较高，但无法有效评估疫苗诱导的中和抗体水平。更重要的是，现有方法大多针对单一物种设计，难以满足跨物种监测的需求。正是基于这些挑战，兰州大学兽医研究所刘新生研究员团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了最新研究成果，开发了一种基于S1蛋白的双抗原夹心ELISA方法，为PDCoV的防控提供了新利器。

研究人员采用了几项关键技术：首先利用CHO细胞系统表达PDCoV S1重组蛋白，通过镍亲和层析纯化后制备HRP标记抗原；采用棋盘滴定法优化ELISA反应条件；使用112份阴性血清和56份阳性血清进行ROC曲线分析确定临界值；通过157份临床血清样本与IFA方法进行一致性验证；最后利用48份阳性血清进行中和试验相关性分析。

S1蛋白的成功表达与验证

研究团队选择PDCoV刺突蛋白的S1亚基作为靶点，因其含有主要中和表位且抗体持久性较好。通过密码子优化后的S1基因在CHO细胞中高效表达，SDS-PAGE显示约100 kDa的单一条带，Western blot验证其特异性，为后续检测方法的建立奠定了坚实基础。

DAgS-ELISA方法的建立与优化

经过系统优化，确定最佳包被抗原浓度为0.6 μg/mL，HRP标记抗原稀释度为1:400，血清稀释比例为1:2。整个检测流程仅需90分钟即可完成，显著提高了检测效率。该方法的最大优势在于采用双抗原夹心设计，同时使用包被抗原和酶标抗原，能够检测不同物种的总抗体，突破了传统方法对种属特异性二抗的依赖。

诊断性能的全面评估

ROC曲线分析显示该方法的AUC值达到0.995，表明其具有极佳的诊断判别能力。当临界值设定为OD₄₅₀=0.16时，灵敏度为92.86%，特异性达99.11%。方法检测限可达血清稀释度1:2048，且与常见猪病病原体无交叉反应，批内和批间变异系数均低于5%，重现性良好。

跨物种检测能力的验证

研究人员使用猪、鸡、兔和小鼠的阳性血清进行验证，所有物种的阳性样本OD值均显著高于临界值，而阴性样本均低于临界值，证明该方法具备出色的跨物种检测能力。这一特性对于监测PDCoV在不同宿主间的传播动态具有重要意义。

与中和抗体的强相关性

通过48份阳性血清的平行检测发现，ELISA的OD值与病毒中和试验滴度呈显著正相关(Pearson r=0.865)。这一发现使得该方法可作为VNT的替代方案，为疫苗免疫效果评估提供了便捷、可靠的量化指标。

该研究的创新之处在于首次建立了基于S1蛋白的PDCoV双抗原夹心ELISA方法，解决了传统检测方法在跨物种应用和中和抗体评估方面的技术瓶颈。选择CHO细胞表达系统确保了S1蛋白的正确折叠和糖基化修饰，保证了抗原的自然构象和免疫反应性。双抗原夹心设计不仅提高了检测的特异性，还实现了真正的跨物种检测，为PDCoV的流行病学调查和传播风险评估提供了有力工具。

值得注意的是，虽然该方法在猪、鸡、兔和小鼠中验证有效，但作者也指出对于野生鸟类、麻雀等潜在宿主仍需进一步验证。随着PDCoV监测范围的扩大和病毒变异监测的深入，这一检测平台有望在疫情防控中发挥更大作用。该研究不仅为PDCoV防控提供了关键技术支撑，其研发策略也为其他新发传染病的检测方法开发提供了有益借鉴。