利用伯克霍尔德菌强组成型启动子p2035/p5642激活革兰氏阴性菌天然产物生物合成

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Identification of strong constitutive promoters in Burkholderia stagnalis TBRC 18363 for activating natural product production in Gram-negative bacteria

本研究针对革兰氏阴性菌天然产物（NP）发现与生产过程中遗传工具匮乏的瓶颈，通过基因组测序和转录组分析从Burkholderia stagnalis TBRC 18363中筛选出26个候选启动子，并在大肠杆菌和恶臭假单胞菌系统中验证其活性。研究发现p2035和p5642启动子在异源宿主中表现出强组成型活性，通过启动子置换实验成功将icosalide和FR900359（Gq/11蛋白抑制剂）的产量分别提高1.6倍和6倍，为解锁革兰氏阴性菌隐性生物合成基因簇（BGC）提供了新型遗传工具。

　　

在微生物药物研发领域，放线菌长期以来占据着天然产物（Natural Products, NPs）发现的中心舞台，约70%的临床抗生素源于此类细菌。然而，随着基因组测序技术的普及，科学家们发现革兰氏阴性菌中隐藏着大量未被开发的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters, BGCs），尤其是伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和染色杆菌属（Chromobacterium）等β-变形菌纲细菌，其编码的次级代谢产物潜力巨大，但多数基因簇在常规实验室条件下保持“沉默”状态。究其原因，缺乏适用于这些菌株的强效、组成型遗传工具（如启动子）是关键瓶颈之一。如何激活这些隐性基因簇，不仅关乎新药发现，也对现有天然产物的工业化生产具有重要意义。

本研究以一株具有广谱抗真菌活性的Burkholderia stagnalis TBRC 18363为研究对象，通过全基因组测序发现其携带20个推定BGCs，包括icosalide和FR900359等已知产物编码基因。为挖掘强启动子，团队在菌株不同生长时期（早、中、晚期指数期）进行转录组（RNAseq）分析，筛选出26个高表达基因的上游序列作为候选启动子。借助Promotech软件预测核心启动子区域后，研究人员构建了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告系统，分别在大肠杆菌BL21(DE3)和恶臭假单胞菌KT2440中评估启动子活性。最终通过同源重组技术将优选启动子置换至目标BGCs上游，并利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测代谢产物产量变化。

启动子在异源宿主中的活性验证

在E. coli BL21(DE3)系统中，p5642、p2035、p5617、p2571和p1173启动子驱动EGFP表达的能力显著高于其他候选者，但均低于诱导型T7启动子。

而在P. putida KT2440中，p2035、p5642和p2111表现出高强度活性，且p2035和p5642在两种宿主中均展现出优异的多物种适应性，表明其具备跨菌属应用的潜力。

启动子工程激活天然产物合成

在B. stagnalis TBRC 18363中，将p2035或p5642启动子插入icosalide合成基因（ics）上游后，icosalide A1产量较无启动子重组对照分别提高1.6倍和1.4倍。

更引人注目的是，在Chromobacterium vaccinii DSM 25150中将FR900359生物合成基因簇的天然启动子替换为p2035后，该G_q/11蛋白抑制剂（与葡萄膜黑色素瘤等癌症治疗相关）的产量提升约6倍，与既往启动子置换研究中的最高增效水平（8倍）相当。

本研究成功鉴定的p2035和p5642启动子，因其在多种革兰氏阴性菌中呈现强组成型活性，且能直接提升天然产物产量，为解锁隐性BGCs和优化工业化生产提供了关键工具。尽管启动子的核心序列特征及其在不同发酵规模下的稳定性仍需进一步探索，但此类工具的丰富将显著加速革兰氏阴性菌来源天然产物的发现与开发进程，尤其在合成生物学倡导的多基因通路重构（promoter refactoring）应用中具有广阔前景。该研究成果发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》，为微生物药物研发领域提供了兼具普适性与高效性的遗传操作新方案。