利用改造柠檬酸合酶的Klebsiella pasteurii NG13提升从气态氮合成L-谷氨酸的产量

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Increased ?-glutamate production from gaseous nitrogen using Klebsiella pasteurii NG13 with modified citrate synthase

为解决传统Haber-Bosch工艺高能耗、高排放问题，研究人员开展基于生物固氮（BNF）的L-谷氨酸（L-Glu）可持续生产研究。通过构建对2-氧代戊二酸（2-OG）抑制不敏感的柠檬酸合酶（CS）变体（KpCS*），并联合过表达柠檬酸转运蛋白（CitS），使Klebsiella pasteurii NG13在连续葡萄糖补料培养中L-Glu产量达到2.35 g L-1，为BNF技术工业化应用提供了新策略。

　　

在当今社会，氮元素是构成食品、药品和化学肥料等众多日常必需材料的基础成分。这些材料中的氮原子通常来源于氨，而氨的工业生产主要依赖哈伯-博世法（Haber-Bosch process）进行化学固氮。然而，这一过程消耗大量化石燃料（约占全球总能耗的2%）并产生显著的二氧化碳排放（约占总排放的1.5%），使其成为不可持续的生产方式。相比之下，固氮细菌（Diazotrophs）能够利用固氮酶将气态氮（N₂）转化为氨，并以此作为氮源合成生长所需的各种初级含氮代谢物，这为可持续生产含氮化合物提供了极具吸引力的替代方案。但是，生物固氮系统本身非常脆弱，因为它包含许多对氧气敏感的酶和蛋白质（如固氮酶），其基因表达调控复杂严格，且需要消耗大量的ATP和还原力，因此至今尚未成功应用于工业规模的含氮化合物微生物生产。

L-谷氨酸（L-Glutamate, L-Glu）是一种具有重要工业价值的氨基酸，不仅用作鲜味调味剂，也是多种含氮化合物的原料。近70年前，利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的L-谷氨酸发酵技术得以开发，并已成为全球发酵生产规模最大的含氮化合物。尽管通过基因工程手段提高了谷氨酸棒杆菌或其他细菌的L-谷氨酸生产率，但所有这些发酵过程都使用通过哈伯-博世法合成的氨作为氮源。研究人员此前关注从水稻根际分离的固氮菌Klebsiella pasteurii（原名K. oxytoca）NG13，并成功对该菌株进行工程化改造，使其能够仅以气态N₂作为氮源生产L-谷氨酸。通过过表达来自谷氨酸棒杆菌的柠檬酸合酶（CS）和/或来自K. pasteurii的柠檬酸转运蛋白（CitS），以增加流向L-谷氨酸前体2-氧代戊二酸（2-OG）的碳通量，在含葡萄糖和柠檬酸的培养基条件下获得了高固氮酶活性，实现了气态N₂衍生的L-谷氨酸生产，产量最高达1.13 g L^-1。然而，研究发现，在同时过表达CgCS和CitS的菌株（CgCS+CitS strain）中，所产生的L-谷氨酸的碳骨架主要来源于培养基中的柠檬酸，而非葡萄糖，这表明该菌株中存在独特的代谢调控。已知CS会被2-OG竞争性抑制（与其天然底物草酰乙酸OAA竞争），因此推测，在CgCS+CitS菌株中观察到的柠檬酸偏向性掺入L-谷氨酸的现象，可能源于被CitS过量摄取的柠檬酸转化生成的2-OG对CS的抑制。

为了验证这一假设并改善碳流向L-谷氨酸，本研究对K. pasteurii的柠檬酸合酶（KpCS）进行了工程化改造，旨在获得对2-OG抑制不敏感的变体，从而提升从葡萄糖生成L-谷氨酸的能力，最终实现更高的总产量。

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用SWISS-MODEL对KpCS进行结构建模和2-OG结合位点预测；采用重叠延伸PCR和定点突变技术构建KpCS变体（KpCS*）表达质粒；通过电穿孔法将质粒转化至K. pasteurii NG13及其基因组KpCS敲除突变体（ΔgKpCS）中；使用Strep标签亲和层析技术纯化KpCS及其变体蛋白；通过酶动力学分析测定变体对底物（乙酰辅酶A、OAA）的K_m、k_cat以及对抑制剂2-OG的K_i值；利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术定量分析胞内外代谢物（L-谷氨酸、柠檬酸、2-OG、葡萄糖）浓度及¹³C标记葡萄糖的掺入情况；通过乙炔还原法测定固氮酶活性；采用连续葡萄糖补料培养策略评估工程菌的L-谷氨酸生产能力。

L-Glu production by K. pasteurii strains overproducing CS and CitS

研究首先确认了在小型化培养条件（Φ25试管，2.5 mL培养基）下，过表达KpCS和CitS的K. pasteurii菌株（KpCS+CitS strain）能产生与之前报道相近水平的L-谷氨酸（约0.49 g L^-1），且其固氮酶活性高于过表达CgCS和CitS的菌株，因此后续研究选用KpCS。添加少量酵母提取物（0.1 g L^-1）是为了促进初始生长并缩短达到足够固氮酶活性表达所需的滞后期，此前研究通过¹⁵N₂掺入实验证实，此条件下超过90%的L-谷氨酸氮源来自气态N₂。

2-OG was a major factor for the unique metabolism of the CS+CitS strain

通过¹³C标记葡萄糖掺入实验，证实KpCS+CitS菌株在基础KDC培养基中产生的L-谷氨酸碳源主要（>90%）来自柠檬酸，而非葡萄糖。当降低培养基中柠檬酸浓度时，葡萄糖来源的L-谷氨酸比例增加。同时，测量细胞内2-OG浓度发现，KpCS+CitS菌株（3.64 ± 0.29 mM）显著高于野生型NG13（0.97 ± 0.27 mM）。为了直接验证2-OG的作用，构建了过表达KpCS和2-OG转运蛋白KgtP的菌株（KpCS+KgtP strain），并在含2-OG的KDO培养基中培养。该菌株产生了0.63 g L^-1的L-谷氨酸，且其中89-93%的碳源来自2-OG。这些结果表明，积累的2-OG（由CitS过量摄取柠檬酸转化而来）抑制了KpCS的活性，从而减少了来自葡萄糖的碳流进入TCA循环，导致L-谷氨酸碳源偏向于外源柠檬酸（或2-OG）。

Prediction of residues of KpCS involved in 2-OG binding

基于KpCS与2-OG的复合物结构模型，预测H227和V362两个氨基酸残基可能影响2-OG的结合。模型显示2-OG的1-羧基伸向H227附近的空腔，而V362也位于该羧基附近。已有报道表明大肠杆菌CS中对应H227的H226突变为Gln可降低对2-OG的亲和力。因此，选择H227和V362作为定点突变的候选位点，以期获得对2-OG抑制不敏感的KpCS变体（KpCS*）。

L-Glu production by modified KpCS-overproducing strains and its carbon origin

构建了在H227或V362位点引入不同性质氨基酸（带正电、带负电、酰胺类、大体积疏水）的KpCS变体，并导入野生型NG13（KpCSstrain）或同时过表达CitS的NG13（KpCS+CitS strain）中。在KDC培养基中培养发现，H227L、H227Q和V362L substitutions能显著提高L-谷氨酸产量。在ΔgKpCS背景菌株中验证也得到一致结果。KpCS+CitS菌株的L-谷氨酸产量（0.52-0.62 g L^-1）高于野生型KpCS+CitS菌株（0.39 g L^-1）。¹³C标记实验显示，KpCS(H227Q)+CitS、KpCS(V362L)+CitS和KpCS(H227L)+CitS菌株产生的L-谷氨酸中，分别有32.8%、29.3%和26.0%来自葡萄糖，显著高于野生型KpCS+CitS菌株的5.5%。这表明KpCS变体能够增加葡萄糖来源的L-谷氨酸合成，从而提升总产量。

Kinetic properties of KpCS*

酶动力学分析表明，野生型KpCS对2-OG的抑制常数K_i^2-OG为0.18 mM。而KpCS(H227Q)、KpCS(H227L)和KpCS*(V362L)变体的K_i^2-OG分别增至0.45 mM、2.22 mM和1.48 mM，即对2-OG的亲和力降低了2.5至12.5倍。同时，这些变体对乙酰辅酶A的K_m值增加，k_cat值普遍降低，但对OAA的K_m值影响不一（H227L和V362L降低，H227Q增加）。尽管催化效率有所下降，但降低的2-OG敏感性使得在细胞内2-OG浓度（~3.64 mM）较高的情况下，CS反应仍能进行，促进了葡萄糖来源的L-谷氨酸生产。

Continuous glucose-fed culture for L-Glu production

考虑到葡萄糖是固氮酶活性能量（ATP和还原力）的来源，且L-谷氨酸生产在葡萄糖耗尽后会停止，研究采用了连续葡萄糖补料（2 g L^-1day^-1）的培养策略。在补料培养中，KpCS(H227Q)+CitS、KpCS(V362L)+CitS和KpCS(H227L)+CitS菌株的L-谷氨酸产量分别达到2.35 g L^-1、1.79 g L^-1和1.71 g L^-1，显著高于野生型KpCS+CitS菌株的0.53 g L^-1。其中KpCS(H227Q)+CitS菌株的产量最高，将此前报道的最高产量（1.13 g L^-1）提升了一倍以上。

本研究通过理性设计获得对2-OG抑制不敏感的Klebsiella pasteurii柠檬酸合酶变体（KpCS），证实2-OG积累是限制工程菌利用葡萄糖合成L-谷氨酸的关键因素。将KpCS与CitS共表达，有效扭转了碳流偏向，显著提高了从葡萄糖到L-谷氨酸的碳通量。在连续葡萄糖补料条件下，工程菌的L-谷氨酸产量实现翻倍，达到2.35 g L^-1，创下了基于生物固氮技术生产该氨基酸的新纪录。这项工作不仅阐明了一种重要的代谢调控机制，而且为开发不依赖哈伯-博世过程的可持续、环境友好型氮素利用策略提供了坚实的技术基础，展示了生物固氮系统在工业化生产含氮化合物方面的巨大潜力。对CS的工程化改造策略也有望应用于其他需要优化TCA循环通路的微生物制造过程。