Burkholderia vietnamiensis G4利用苯甲醇及其酯类共代谢降解三氯乙烯的机制与性能研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Toluene-2-monooxygenase expression and trichloroethene oxidizing activity of Burkholderia vietnamiensis G4 grown on benzyl alcohol and benzyl esters

为解决传统共代谢底物（如甲苯、苯酚）本身具有毒性和环境风险的问题，研究人员开展了利用“公认安全”（GRAS）化合物苯甲醇（BA）及其酯类作为新型底物，促进Burkholderia vietnamiensis G4表达T2MO并降解TCE的研究。结果表明，BA及其酯类能有效支持菌株生长并诱导T2MO高表达，其降解TCE的比速率和转化容量（Tc）均优于甲苯，为原位生物修复提供了更安全、高效的底物选择。

　　

三氯乙烯（TCE）是一种常见的、具有致癌性的地下水污染物。利用微生物的共代谢作用进行原位生物修复是一种经济有效的治理策略。在这一过程中，微生物利用一种易于降解的初级底物（如甲苯或苯酚）进行生长，同时其产生的非特异性加氧酶（如T2MO）能够“顺便”降解TCE。然而，甲苯和苯酚本身也是美国环保署（US EPA）优先控制的污染物，在环境中使用存在二次污染的风险。因此，寻找一种既安全又能有效诱导关键降解酶表达的新型底物，对于推动TCE污染场地的绿色修复至关重要。

苯甲醇（BA）是一种“公认安全”（GRAS）的食品级化学品，其酯类（如苯甲酸丁酯，BBu）也广泛用作食品香料。此前有研究表明，BA能够支持混合微生物群落共代谢降解TCE，但其具体作用机制和关键酶系尚不明确。本研究旨在系统评估BA及其酯类作为Burkholderia vietnamiensis G4（一种经典的TCE共代谢菌）生长底物的潜力，并深入探究其对T2MO表达及TCE降解性能的影响。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用静息细胞实验测定TCE、VC、cis-DCE和1,1-DCE的降解动力学参数（比速率和转化容量T_c）；利用基于活性的蛋白标记（ABL）技术，结合荧光成像和SDS-PAGE分析，对T2MO羟化酶亚基进行定性和半定量分析；通过底物特异性O₂摄取实验，探究BA的代谢途径；通过添加特异性抑制剂丙炔（propyne）和竞争性抑制实验，验证T2MO在BA代谢和TCE降解中的关键作用。

生长测试与T2MO表达验证

研究人员首先证实了B. vietnamiensis G4能够以BA和BBu作为唯一碳源和能源进行生长。在BBu培养体系中，BA作为中间产物出现并随后被消耗，而T2MO的特异性抑制剂丙炔能够完全抑制BA的消耗和菌体生长，表明T2MO是BA代谢的起始酶。活性标记（ABL）实验进一步证明，在以BA、BBu和苯甲酸乙酯（BAc）为底物生长的细胞中，T2MO羟化酶亚基的表达水平与甲苯或苯酚诱导的水平相当甚至更高，而乳酸、乙酸或丁酸等非芳香族底物则无法诱导T2MO的表达。

氯代烃降解性能评估

静息细胞实验结果显示，BA和BBu诱导的细胞降解TCE的比速率（分别为2.18和2.20 μmol/day/mg TSS）高于甲苯诱导的细胞（1.75 μmol/day/mg TSS）。更重要的是，BA诱导细胞的TCE转化容量（T_c，0.63 μmol/mg TSS）比甲苯诱导细胞（0.47 μmol/mg TSS）高出约35%，而BBu诱导细胞的T_c（1.46 μmol/mg TSS）更是甲苯诱导细胞的3倍以上。此外，BA诱导的细胞还能有效降解TCE的降解产物，包括VC、cis-DCE和1,1-DCE，且对这些化合物的转化容量也普遍高于甲苯诱导的细胞。

BA代谢途径与T2MO底物特异性

竞争性抑制实验表明，BA和甲苯一样，能够抑制T2MO对TCE的降解，证实了BA是T2MO的竞争性底物。底物特异性O₂摄取实验发现，2-羟基苯甲醇（2-hydroxybenzyl alcohol）能够显著刺激细胞耗氧，而苯甲醛（benzaldehyde）则不能，这提示BA的代谢途径可能涉及芳香环的羟基化，而非侧链的氧化，这与T2MO的催化特性相符。

研究结论与讨论

本研究首次系统证实了BA及其酯类是B. vietnamiensis G4的有效生长底物，并能高效诱导T2MO的表达。与传统的甲苯和苯酚相比，BA诱导的细胞在降解TCE方面表现出更高的转化容量（T_c），这意味着单位生物量能够降解更多的污染物，这对于实际应用具有重要意义。

研究人员推测，这种更高的T_c值可能与细胞内部能量储存物质（如聚羟基脂肪酸酯，PHA）的积累有关。BA及其酯类（特别是BBu）的代谢可能促进了PHA的合成，从而增强了细胞在降解污染物过程中的耐受性和持久性。这一推测为未来研究提供了新的方向。

最重要的是，BA及其酯类作为“公认安全”（GRAS）化合物，其环境风险远低于甲苯和苯酚。因此，它们有望成为原位生物修复中更安全、更可持续的底物选择。未来，这些化合物既可以作为缓释底物直接用于刺激原位微生物群落，也可以与高效降解菌（如B. vietnamiensis G4）共同包埋，构建高效、持久的生物修复系统，为TCE等氯代烃污染场地的治理提供新的解决方案。