工程化CCL20锁定二聚体体内生物安全性评估：靶向CCR6/CCL20轴治疗Th17相关疾病的新策略

《Cell Biology and Toxicology》：Biosafety assessment of engineered CCL20 locked dimers in vivo

本研究针对Th17细胞驱动的自身免疫性疾病治疗中存在的系统性免疫抑制等挑战，开展了工程化CCL20锁定二聚体（CCL20LD）的体内生物安全性评估。通过14天小鼠皮下给药实验，发现治疗有效剂量下的CCL20LD未引起体重减轻或免疫抑制，血液学、临床化学等指标均无显著异常，仅在最高剂量（22.5 mg/kg/天）下出现脾肿大和髓外造血现象。结果表明CCL20LD具有宽广的治疗窗口和良好的安全性，为开发靶向CCR6/CCR20轴的精准免疫疗法提供了重要依据。

　　

在免疫系统这座精密的人体防御网络中，趋化因子如同传递信息的信号弹，指引免疫细胞前往需要它们的战场。然而，当信号传递出现紊乱——即免疫失调发生时，便会引发一系列自身免疫性疾病和炎症性疾病。其中，由Th17细胞及其产生的白细胞介素-17（IL-17）扮演着关键角色，它们与银屑病、银屑病关节炎、炎症性肠病（IBD）等多种疾病的发病机制密切相关。

当前，针对Th17通路的相关疗法，如TNF抑制剂、JAK抑制剂以及靶向IL-17/IL-23的生物制剂（如司库奇尤单抗、依奇珠单抗等），虽显示出临床疗效，但也伴随着系统性免疫抑制、感染风险增加、甚至诱发 paradoxical 炎症反应（如新发炎症性肠病）等局限性。因此，开发能够选择性调节致病性Th17细胞功能而不损害整体免疫保护力的新疗法，成为领域内亟待突破的瓶颈。

在Th17细胞的迁移和炎症部位聚集过程中，CCR6-CCL20这一对趋化因子受体-配体轴起到了核心作用。CCL20是CCR6的唯一配体，这种一对一的关系在普遍存在“多对多”结合的趋化因子系统中显得尤为独特，使其成为极具吸引力的精准治疗靶点。然而，靶向GPCR（G蛋白偶联受体）的小分子抑制剂开发常因特异性、受体冗余性和靶点毒性等问题而折戟。

面对这一挑战，Michael B. Dwinell教授团队另辟蹊径，他们利用蛋白质工程手段，通过对天然CCL20进行单氨基酸替换，设计出一种能够稳定形成同源二聚体的“锁定二聚体”——CCL20LD。这种工程化分子能选择性结合CCR6，并作为部分激动剂，在诱导GPCR激活的同时最大限度地减少趋化活性，从而有效阻断CCR6介导的免疫细胞迁移。前期研究已证实，CCL20LD能在银屑病和银屑病关节炎的小鼠模型中减轻炎症、减少IL-17A和IL-22信号，显示出良好的治疗潜力。

任何有前景的候选疗法在走向临床前，都必须经过严格的生物安全性评估。鉴于CCR6在黏膜免疫、派尔集合淋巴结形成和免疫细胞稳态中的重要作用，评估CCL20LD是否会导致免疫抑制或不良影响至关重要。为此，研究人员开展了一项系统的临床前安全性研究，旨在全面评价CCL20LD在小鼠体内的系统性、血液学和免疫学效应，其结果发表于《Cell Biology and Toxicology》。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用蛋白质工程表达和纯化CCL20LD；在小鼠（CD1和C57BL/6J品系）中进行不同剂量（2.5, 7.5, 22.5 mg/kg/天）和给药途径（皮下、腹腔）的重复给药毒性实验；通过全面的临床病理学分析（包括血液学、血清生化、尿液分析）评估系统性毒性；通过称重和组织学检查评估器官毒性；利用流式细胞术分析外周血、脾脏和骨髓中的免疫细胞群及造血祖细胞群；采用多因子检测（Luminex）分析血清细胞因子水平；并对脾细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）以在转录组水平揭示免疫细胞的细微变化。

系统性和局部宏观观察

研究人员首先对10周龄的CD1小鼠进行了为期14天的每日皮下给药（溶剂PBS、2.5、7.5或22.5 mg/kg/天 CCL20LD）研究。结果显示，2.5 mg/kg和7.5 mg/kg剂量组耐受性良好，对存活率和体重无显著影响。在最高剂量（22.5 mg/kg）下，20只动物中有3只死亡或被人道处死，但尸检未确定死因。注射部位反应在最高剂量组的两只小鼠中被观察到，包括血清细胞性结痂和中度混合细胞炎症。通过多元逻辑回归分析发现，长时间高剂量注射可能轻微增加注射部位结痂风险，但最大的影响因素是性别（雌性愈合更快），这与已知的雌性小鼠伤口愈合更快的现象一致。

血液学、临床化学和尿液分析评估

血液学参数分析表明，CCL20LD对所有剂量的红细胞相关参数（计数、血红蛋白、血细胞比容等）和血小板计数均无显著影响。在最高剂量下，雄性小鼠网织红细胞计数增加了33%，但仍在健康CD1小鼠的参考范围内。临床化学评估显示，各剂量组的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）/丙氨酸氨基转移酶（ALT）比值（De Ritis比值）无变化。尽管在个别剂量点观察到ALT、AST和碱性磷酸酶（ALP）的轻微统计学变化，但这些值均在正常参考范围内，提示临床相关性有限。组织损伤的关键标志物，如总胆红素（TBIL）、肌酐（CREAT）等均无变化。电解质水平基本稳定，尿液分析也未发现异常。这些结果表明CCL20LD对肝肾功能影响甚微。

对器官重量的影响

尸检器官称重分析显示，肾上腺、脑、心脏、肾脏、肝脏/胆囊、胸腺以及生殖器官的绝对重量和相对重量（占体重百分比%bw，占脑重百分比%br）在各剂量组均无显著变化。然而，在最高剂量组，雄性和雌性小鼠的脾脏绝对重量、%bw和%br均显著增加。组织学检查发现，接受≥7.5 mg/kg/天 CCL20LD的小鼠脾脏红髓中出现了髓外造血，表现为红细胞系和巨核细胞系前体细胞的扩增。结合循环中网织红细胞的增加，这些发现支持CCL20LD诱导了脾脏髓外造血的模型，这与之前关于CXCR4或CXCR1/2抑制剂的研究观察相似。

对免疫系统的影响

对外周血免疫细胞群体的分析显示，各剂量组的总白细胞计数无显著变化。然而，最高剂量（22.5 mg/kg/天）的雄性小鼠循环中性粒细胞（CCR6阴性群体）的比例和绝对数量增加了约两倍，提示存在间接机制。同一剂量下，雄性小鼠的淋巴细胞水平下降了约15%。单核细胞和嗜酸性粒细胞水平无变化，而雄性小鼠的嗜碱性粒细胞和大型未染色细胞（LUCs）增加了五倍，但仍处于参考范围内。

为了更细致地研究对免疫系统的影响，研究人员在更常用的C57BL/6J雄性小鼠模型中，采用了隔日腹腔注射（100μg 或 200μg CCL20LD，持续21天）的方案。流式细胞术分析显示，与CD45⁺细胞相比，脾脏中总CD3⁺T细胞、CD4⁺/CD8⁺T细胞亚群、记忆T细胞、B细胞、髓系细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的频率基本无显著变化。仅在200μg剂量组观察到Ly6C^-巨噬细胞的轻微增加和初始CD4⁺T细胞减少10%。血清细胞因子多重分析未发现显著变化，但显示了某些效应细胞因子（如IL-17, IL-10, IL-4, IFNγ）在早期时间点有下降趋势，而粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和IL-3在后期有上升趋势，后者可能与髓外造血有关。

对骨髓的影响

鉴于脾脏变化，研究人员进一步分析了骨髓中的免疫细胞和祖细胞。流式细胞术发现，骨髓中CD4⁺和CD8⁺T细胞水平下降了25%，B细胞下降了30%，但NK细胞无变化。髓系细胞和中性粒细胞略有增加。在造血祖细胞分析中，谱系阴性（LIN^-）细胞比例无变化。但相对于LIN^-群体，造血干细胞（HSC, LIN^-Sca-1⁺cKIT⁺）增加了30%，普通髓系祖细胞（CMP, LIN^-Sca-1^-cKIT⁺CD16/32^-CD34⁺）显著增加了80%。而普通淋巴祖细胞（CLP）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）和巨核细胞-红系祖细胞（MEP）无变化。HSC的增加支持了脾脏髓外造血的现象，并提示其机制可能与HSC动员有关，而非炎症或病理状态的反应。

单细胞RNA分析

对C57BL/6小鼠脾细胞进行的单细胞RNA测序分析，从转录组层面提供了更深入的见解。伪批量分析显示，CCL20LD处理的小鼠脾细胞中，与细胞增殖相关的基因通路上调，这与观察到的脾肿大和髓外造血一致。免疫群体频率分析确认了中性粒细胞和巨噬细胞的相对增加，以及B细胞（特别是滤泡B细胞）的相对减少（约25%）。进一步分析发现，滤泡B细胞是脾细胞中CCR6表达最高的群体。CCL20LD处理组小鼠的滤泡B细胞中，与T细胞非依赖性B细胞分化相关的基因（如II4i1, Tlr9, Irf5）上调，而对照组小鼠的滤泡B细胞中，与经典T细胞依赖性B细胞活化相关的基因（如Zbtb20, Irf4, Tcf4）表达更高。这些发现与CCR6基因敲除（CCR6KO）模型中的观察相似，表明CCL20LD干扰了T细胞依赖性B细胞活化。

研究结论与意义

这项综合性的生物安全性研究表明，在治疗银屑病或银屑病关节炎有效的剂量下，工程化CCL20锁定二聚体（CCL20LD）在小鼠体内表现出良好的安全性和耐受性，具有宽广的治疗窗口。在最低测试剂量下，唯一的副作用是轻微的注射部位结痂。只有在远高于治疗所需的高剂量（22.5 mg/kg/天）下，才观察到脾脏髓外造血和轻微的免疫调节效应，如初始T细胞减少、记忆T细胞增加以及B细胞功能的特定改变。重要的是，CCL20LD并未导致广泛的免疫抑制或对造血祖细胞产生毒性。

该研究的发现为将CCL20LD进一步开发为治疗CCR6/CCL20轴相关疾病（如多种自身免疫病、炎症性疾病）的候选药物提供了重要的临床前安全性数据支撑。其独特的机制——作为部分激动剂选择性阻断CCR6，而非完全拮抗或导致广泛免疫抑制——展现了一种潜在的更精准的免疫干预策略。特别值得注意的是，CCL20LD对B细胞记忆形成的调节作用，虽然可能在健康个体中影响疫苗应答，但或许能为其在由自身反应性记忆B细胞驱动的疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎）中提供额外的治疗益处。当然，CCL20LD对黏膜免疫（如肠道派尔结）的潜在影响，以及其在炎症背景下更详细的免疫调节作用，将是未来需要深入探索的方向。总体而言，这项研究标志着向利用工程化趋化因子进行靶向免疫治疗迈出了坚实的一步。