ZAR1基因突变破坏母源mRNA储存导致人类卵母细胞成熟缺陷的机制研究

《Cellular and Molecular Life Sciences》：ZAR1 pathogenic variants disrupt maternal mRNA storage and cause oocyte maturation defects in humans

本研究针对女性不孕症中卵母细胞成熟障碍及早期胚胎发育停滞的临床难题，通过全外显子测序技术在国际上首次发现ZAR1基因致病性变异（c.353T>C/p.V118A、c.1190G>A/p.R397Q和c.362C>A/p.S121*）与人类生殖缺陷的直接关联。研究人员通过功能实验证实这些变异通过破坏线粒体相关核糖核蛋白结构域（MARDO）的相分离形成和RNA结合能力，导致母源mRNA储存异常，最终引发卵母细胞减数分裂缺陷和胚胎发育停滞。该成果不仅揭示了ZAR1在人类生殖中的关键作用，为相关不孕症的遗传诊断提供了新靶点，更深化了对母源-合子转换（MZT）过程中转录本调控机制的理解。

　　

在全球范围内，不孕症影响着数百万育龄人群，而辅助生殖技术（ART）已成为解决这一难题的重要途径。随着体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术的广泛应用，越来越多通过ART孕育的婴儿降临人世。然而，临床上仍有部分女性患者面临反复植入前胚胎发育停滞（RPEA）的困境，其卵母细胞虽能成功受精，却往往停滞在2细胞至7细胞阶段，最终导致妊娠失败。这类生殖障碍的分子机制长期以来是生殖医学领域的未解之谜。

卵母细胞的成熟过程包括核成熟与质成熟两个关键环节，其中质成熟涉及细胞骨架组装、细胞器分布以及母源mRNA的储存与降解等复杂生物学事件。值得注意的是，卵母细胞减数分裂和早期胚胎发育都处于转录沉默状态，这一时期完全依赖母源储存的mRNA维持生命活动，直至受精后合子基因组激活（ZGA）才开始胚胎基因的转录。因此，母源mRNA的精确储存与适时降解对卵母细胞发育和胚胎发育至关重要。近年研究发现，线粒体相关核糖核蛋白结构域（MARDO）作为哺乳动物卵母细胞中无膜结构的mRNA储存中心，其核心组分ZAR1蛋白的功能异常可能与生殖缺陷密切相关。

在《Cellular and Molecular Life Sciences》最新发表的研究中，廖修全、赵帅、张长龙等研究者通过多中心合作，首次揭示了ZAR1基因突变导致人类卵母细胞成熟障碍和早期胚胎停滞的分子机制。研究人员对临床表现为原发性不孕的患者进行全外显子测序，发现两个独立家系中存在ZAR1基因的纯合突变（c.353T>C/p.V118A）和复合杂合突变（c.1190G>A/p.R397Q和c.362C>A/p.S121*）。为验证这些变异的致病性，团队构建了系列突变体质粒，通过显微注射技术在鼠卵母细胞中开展功能拯救实验，并结合免疫共沉淀（Co-IP）、RNA免疫共沉淀（RIP）、实时定量PCR（RT-qPCR）等多组学技术深入解析其分子通路。

关键实验方法概述

研究纳入来自中信湘雅生殖与遗传医院和山东大学生殖医学中心的临床样本，通过全外显子测序筛选致病突变。利用体外转录技术合成野生型及突变型ZAR1 mRNA，通过显微注射导入小鼠生发泡（GV）期卵母细胞进行功能验证。采用蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色、活细胞成像等技术分析蛋白表达与定位，通过poly(A) FISH检测mRNA空间分布，并运用Trim-Away技术特异性敲低内源ZAR1蛋白以评估突变体功能。

ZAR1突变体的功能表征

研究发现，位于ZAR1蛋白固有无序区域（IDR）的V118A突变虽不影响蛋白表达水平，但显著破坏其相分离能力。活细胞成像显示，GFP-hZAR1^WT能形成与线粒体共定位的细胞质簇状结构，而GFP-hZAR1^V118A则呈弥散分布，表明该突变阻碍MARDO结构的正常组装。进一步实验证实，V118A突变并不影响ZAR1与RNA结合蛋白MSY2、LSM14B的相互作用，但导致这些关键组分在卵母细胞中的定位紊乱。

MARDO功能紊乱的分子后果

通过poly(A) FISH技术检测发现，hZAR1^V118A过表达卵母细胞中mRNA的线粒体周边聚集显著减少，证实MARDO的mRNA储存功能受损。RT-qPCR分析显示，突变组中关键转录因子表达水平下降，与Zar1基因敲除鼠（GEO: GSE93941）的转录组数据高度一致。这些结果提示V118A突变通过破坏MARDO空间结构，导致母源mRNA异常降解，进而影响卵母细胞成熟。

RNA结合域突变的影响机制

对位于ZF-3CxxC结构域的R397Q突变和导致蛋白截短的S121*突变的研究表明，这两种变异均显著削弱ZAR1的RNA结合能力。RIP实验显示，突变体与目标mRNA的结合效率较野生型下降约50%-70%。在敲低内源mZAR1的卵母细胞中，过表达hZAR1^WT可挽救纺锤体组装异常，而hZAR1^R397Q和hZAR1^S121*则无法恢复正常表型，证实其功能缺失效应。

讨论与展望

本研究首次将小鼠中公认的母源效应基因ZAR1的功能研究拓展至人类生殖领域，揭示其通过相分离机制组装MARDO结构，在维持母源mRNA稳定性中发挥关键作用。值得注意的是，人类胚胎中母源mRNA清除模式与小鼠存在物种差异：人类大部分母源转录本在8细胞阶段降解，而小鼠则在MII期卵母细胞和合子阶段即完成清除，这提示人类需要更精细的mRNA保护机制。ZAR1可能通过三种途径发挥保护作用：直接结合mRNA并将其锚定于MARDO；空间阻遏CCR4-NOT等RNA降解复合物的接近；招募其他RNA结合蛋白协同抗降解。

该研究也存在值得深入探讨的发现：虽然人ZAR1的V118A突变显著破坏相分离，但小鼠同源位点V88A突变却未产生明显表型。人与鼠ZAR1蛋白序列同源性仅59%，其N端IDR区域差异可能解释这种物种特异性。此外，hZAR1^V118A突变体在胞质相分离能力丧失的同时出现核内聚集现象，提示相分离可能通过空间阻遏机制调控蛋白的核-质分布。

这项研究为女性不孕症的遗传诊断提供了新的分子标志物，深化了对母源-合子转换过程中转录本调控机制的理解，为开发针对卵母细胞成熟障碍的干预策略奠定了理论基础。未来需要进一步探索ZAR1在人类MZT过程中的动态表达规律，并在更大临床队列中验证其突变谱与生殖表型的关联。