靶向OTUD7A/KDM5B/GABPA轴通过诱导铁死亡增强KRAS突变肺腺癌对顺铂的敏感性

《Cell Death & Disease》：Suppressing the OTUD7A/KDM5B/GABPA axis enhances the sensitivity of cisplatin through inducing ferroptosis in KRAS-mutant LUAD

本研究针对KRAS突变肺腺癌（LUAD）对铂类化疗药物敏感性差的临床挑战，揭示了OTUD7A通过去泛素化稳定KDM5B，进而调控H4K20me3水平影响转录因子GABPA表达，最终抑制线粒体ROS产生和铁死亡的新机制。结果表明，抑制该信号轴可显著增强顺铂（CDDP）诱导的铁死亡，为克服KRAS突变LUAD的化疗耐药提供了新的靶点和联合治疗策略。

　　

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中肺腺癌（LUAD）是最常见的亚型。KRAS基因突变是LUAD中重要的驱动基因突变之一，然而，由于其蛋白浅平的活性口袋导致药物结合亲和力弱，针对KRAS突变的有效治疗策略一直是临床面临的巨大挑战。与其它类型的LUAD相比，KRAS突变肺腺癌进化出了更为复杂的抗氧化代谢机制，导致其对常规铂类药物的敏感性更差。细胞铁死亡（Ferroptosis）作为一种新发现的细胞死亡方式，与传统的、常因耐药而受阻的细胞凋亡（Apoptosis）相比，在癌症治疗中展现出独特的特征和潜在的治疗效果。因此，探索KRAS突变LUAD中铁死亡的调控机制，并以此为基础开发新的增敏策略，具有重要的科学意义和临床价值。

在此背景下，由Si Rujia、Shen Ziyang、Sui Ying等作为共同第一作者，Xu Cong和Shen Bo作为共同通讯作者的研究团队在《Cell Death & Disease》上发表了一项重要研究。为了深入探究KRAS突变LUAD中铁死亡的调控机制，研究人员综合运用了细胞生物学、分子生物学、表观遗传学以及动物模型等多种技术手段。研究主要利用了人KRAS突变LUAD细胞系（如A549和SW1573）以及小鼠模型（包括皮下移植瘤模型和基于裸鼠的人源肿瘤异种移植PDX模型）。临床样本来源于南京医科大学附属肿瘤医院的样本库。关键技术包括：细胞增殖与毒性检测（CCK-8、LDH、EdU法）、蛋白质印迹（Western Blot, WB）分析关键蛋白表达、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）分析组蛋白修饰和转录因子结合、免疫共沉淀（Co-IP）和体内泛素化实验验证蛋白质相互作用与修饰、流式细胞术检测线粒体膜电位（JC-1染色）、活性氧（ROS, 使用MitoSOX探针）、脂质过氧化（使用BODIPY C11探针）和铁离子（Fe²⁺）水平、以及透射电子显微镜观察线粒体形态等。

KDM5B通过去甲基化H4K20me3位点上调GABPA表达，促进KRAS突变LUAD细胞系增殖

研究人员首先通过生物信息学分析发现，在TCGA-LUAD数据库中，KDM5B（Lysine Demethylase 5B）在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织，且在KRAS突变型LUAD中的表达也显著高于KRAS野生型组。通过在A549和SW1573细胞中构建KDM5B的稳定敲低和过表达细胞系，功能实验证实KDM5B过表达显著增强细胞增殖，而其敲低则抑制增殖并增加细胞死亡率。为了探究其作用机制，研究人员进行了KDM5B的染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq），并结合基因表达分析，将下游关键靶点锁定为转录因子GABPA（GA Binding Protein Transcription Factor Subunit Alpha）。双荧光素酶报告基因实验证明KDM5B过表达能增强GABPA启动子的转录活性。进一步研究发现，KDM5B主要通过去除组蛋白H4第20位赖氨酸的三甲基化修饰（H4K20me3）来发挥其功能。梯度转染实验显示，KDM5B的表达水平与H4K20me3水平呈负相关。ChIP-Seq分析表明，敲低KDM5B后，全基因组范围内H4K20me3信号增强，并在GABPA启动子区域有明显富集。这些结果提示KDM5B通过去甲基化H4K20me3，解除其对GABPA转录的抑制，从而促进GABPA表达，驱动肿瘤细胞增殖。

抑制KDM5B-GABPA轴促进KRAS突变LUAD细胞和类器官中线粒体ROS增加，诱导铁死亡并增强对顺铂的敏感性

鉴于GABPA在线粒体功能和能量代谢中的关键作用，研究人员推测KDM5B-GABPA轴可能通过调控线粒体活性氧（ROS）影响铁死亡敏感性。蛋白质印迹（WB）分析显示，敲低KDM5B或GABPA后，铁死亡关键负调控因子如GPX4（Glutathione Peroxidase 4）、SLC7A11（Solute Carrier Family 7 Member 11）、FTH1（Ferritin Heavy Chain 1）和NRF2（NF-E2-related factor 2）的表达显著下调。在使用顺铂诱导铁死亡的条件下，流式细胞术检测发现，敲低KDM5B或GABPA会导致线粒体膜电位下降，细胞内ROS、Fe²⁺和脂质过氧化水平显著升高；而过表达KDM5B或GABPA则抑制这些变化，稳定线粒体膜电位。透射电镜结果直观显示，KDM5B敲低组细胞线粒体形态异常，嵴膜消失，符合铁死亡的超微结构特征。更重要的是，在基于患者来源的KRAS突变LUAD类器官体内模型中，联合使用顺铂和GABPA抑制剂（si-GABPA）相比单一处理，能更有效地抑制肿瘤生长，表明靶向GABPA可显著增强顺铂的治疗效果。

OTUD7A通过与KDM5B相互作用调控KRAS突变LUAD的铁死亡

为了寻找调控KDM5B稳定性的上游因子，研究人员对去泛素化酶（DUB）家族进行了筛选，发现敲低OTU去泛素化酶7A（OTUD7A）能最显著地降低KDM5B的蛋白水平。Co-IP和免疫荧光共定位实验证实了OTUD7A与KDM5B之间存在直接的相互作用。通过结构域分析，进一步确定KDM5B的JmjC结构域与OTUD7A的OTU结构域特异性结合。功能上，过表达OTUD7A能促进细胞增殖，减少细胞死亡，并抑制顺铂诱导的线粒体ROS产生、脂质过氧化和铁死亡；而敲低OTUD7A则产生相反效应。分子机制上，OTUD7A过表达能上调KDM5B及其下游GABPA的表达，进而增强GPX4等铁死亡抑制因子的表达。这些效应依赖于KDM5B的存在。体内动物实验也验证了OTUD7A/KDM5B/GABPA轴的功能，过表达OTUD7A、KDM5B或GABPA均能促进肿瘤生长，而联合过表达OTUD7A和KDM5B的同时敲低GABPA，则能逆转促瘤效应。

OTUD7A特异性去除K48连接的泛素链，促进KDM5B的去泛素化，从而稳定KDM5B蛋白表达水平

深入机制探索表明，OTUD7A对KDM5B的稳定作用依赖于其去泛素化酶活性。梯度转染和挽救实验证明，野生型OTUD7A能稳定KDM5B蛋白，而其失活突变体（L233F）则无此功能。蛋白半衰期实验显示，敲低OTUD7A会加速KDM5B蛋白的降解。蛋白酶体抑制剂MG132的处理实验提示，OTUD7A通过泛素-蛋白酶体途径调控KDM5B。体内泛素化实验最终证实，OTUD7A过表达能显著降低KDM5B的泛素化水平，而敲低OTUD7A则增加其泛素化。更重要的是，研究人员发现OTUD7A特异性去除KDM5B上K48连接的泛素链，这种连接通常靶向蛋白进行降解，从而解释了OTUD7A稳定KDM5B蛋白的分子基础。

本研究首次揭示了OTUD7A-KDM5B-GABPA信号轴在调控KRAS突变肺腺癌铁死亡中的核心作用。该轴通过将蛋白质稳定性调控（OTUD7A介导的KDM5B去泛素化）与表观遗传调控（KDM5B介导的H4K20me3去甲基化）联系起来，精细调控下游线粒体功能相关转录因子GABPA的表达，进而影响细胞的氧化还原平衡和铁死亡敏感性。研究不仅深化了对KRAS突变肿瘤代谢适应和耐药机制的理解，更重要的是，提出了将顺铂与靶向GABPA（或上游OTUD7A/KDM5B）的铁死亡诱导策略相结合的联合治疗新思路。这项工作为克服KRAS突变LUAD的化疗耐药提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点，展现了表观遗传调控与细胞代谢死亡机制交叉研究的重要价值。