靶向分泌型磷脂酶A2与EGFR及波形蛋白相互作用以抑制前列腺肿瘤生长

《Cell Death & Disease》：Targeting secreted PLA2 interactions with EGFR and vimentin to arrest prostate tumour growth

本研究针对晚期前列腺癌（PCa）缺乏有效疗法的难题，聚焦于分泌型磷脂酶A2（hGIIA）的非催化功能。研究人员开发了新型环肽cF和c2，特异性抑制hGIIA与表皮生长因子受体（EGFR）和波形蛋白（vimentin）的相互作用。结果表明，c2能有效阻断hGIIA介导的炎症信号放大和肿瘤细胞存活通路，在多种前列腺癌动物模型中显著抑制肿瘤生长并诱导凋亡，且口服生物利用度高、无显著毒性，为治疗去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）提供了全新策略。

　　

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，当疾病进展到去势抵抗阶段（mCRPC）时，治疗选择变得非常有限，预后极差。传统的治疗方法往往靶向雄激素信号通路，但耐药性的出现几乎是不可避免的。因此，寻找新的、作用于非雄激素依赖性通路的关键靶点，成为攻克晚期前列腺癌的迫切需求。近年来，肿瘤微环境中的炎症反应被证实是驱动肿瘤发生发展的关键因素。在这个过程中，一种名为分泌型磷脂酶A₂-IIA（hGIIA）的酶引起了科学家的注意。hGIIA在前列腺癌组织中高度表达，且其水平与肿瘤的恶性程度密切相关。过去，针对hGIIA的药物研发主要集中在其酶活性上，但相关的抑制剂在临床试验中因疗效不佳或潜在毒性而失败。这促使研究人员思考：hGIIA促进癌症进展，是否主要不依赖于其“剪刀”般的酶切功能，而是通过其作为“连接桥”的蛋白-蛋白相互作用来实现？发表在《Cell Death & Disease》上的这项研究，正是为了回答这个关键问题，并在此基础上开发出了一类全新的、具有广阔应用前景的治疗策略。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们利用生物信息学数据库分析了hGIIA基因（PLA2G2A）在肿瘤中的表达谱。基于hGIIA蛋白结构，通过计算机辅助药物设计合成了环肽cF和c2。通过药代动力学实验（包括使用放射性标记和LC-MS/MS技术）评估了肽类化合物的口服生物利用度和组织分布。利用多种前列腺癌细胞系（如LNCaP, PC-3, DU145）和类风湿性关节炎来源的成纤维样滑膜细胞（RA57）进行体外机制研究，包括活细胞成像、荧光寿命成像（FLIM）、免疫共沉淀、酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术。构建了CRISPR-Cas9介导的波形蛋白敲除细胞系以验证特异性。最后，在免疫缺陷小鼠身上建立了三种不同的前列腺癌异种移植模型（雄激素敏感型、去势抵抗型和雄激素非依赖型）来评估cF和c2的体内抗肿瘤效果和安全性，并进行了符合OECD标准的28天重复给药毒性试验。

cF和c2是口服可利用、无毒性且细胞渗透性的

研究人员首先确认hGIIA是一个值得关注的目标，因为公共数据库显示其编码基因PLA2G2A在前列腺癌中转录水平最高。接着，他们基于hGIIA蛋白的⁷⁰FLSYK⁷⁴序列，设计并合成了环状五肽cF及其类似物c2。药代动力学研究表明，无论是皮下注射还是口服给药，cF和c2都能被小鼠吸收并进入血液循环，cF的血药浓度约为c2的10倍。两种肽在肝脏和肾脏中均有分布，并且在大鼠模型中，c2能够通过口服吸收进入血浆和多种组织，最终主要通过粪便排泄。至关重要的是，在长达10周的小鼠实验和符合国际标准的28天大鼠重复剂量毒性实验中，即使在高剂量下，c2也未显示出任何明显的器官损伤或血液生化指标（如肌酸激酶CK，反映心脏损伤）的异常，证明了其卓越的安全性。此外，c2因其分子中的萘基结构而具有独特的自发荧光特性，这使得研究人员能够直接观察其在活细胞内的定位。实验证实，c2能够有效地进入多种前列腺癌细胞，并以点状模式分布在细胞内，证明了其良好的细胞渗透性。

cF和c2在异种移植模型中减小肿瘤体积并提高动物存活率

为了评估疗效，研究团队在三种不同的前列腺癌小鼠模型中测试了cF和c2。在雄激素敏感的LNCaP-luc模型中，口服cF（2 mg/kg/天）或c2（0.1 mg/kg，每周三次）治疗均能显著抑制肿瘤体积的增长，并伴随有前列腺特异性抗原（PSA）水平和生物发光信号降低的趋势。在模拟临床去势治疗后的耐药模型中，cF治疗同样显著减缓了肿瘤的生长。在最具挑战性的雄激素非依赖性PC-3M-luc模型中，c2和cF治疗不仅显著延缓了肿瘤进展，更令人振奋的是，部分小鼠（c2组27%，cF组13%）存活至实验结束（6个月），而所有对照组小鼠在9周内均因肿瘤过大而被安乐死。在存活的动物中，部分甚至出现了肿瘤完全消退的现象。对肿瘤组织的分析显示，c2治疗显著增加了肿瘤细胞的凋亡（TUNEL染色阳性），这表明c2能够有效逆转前列腺癌细胞的凋亡抵抗。

自分泌和旁分泌的hGIIA均可被内化并被c2抑制

机制探索从hGIIA如何进入细胞开始。研究人员用荧光标记的hGIIA（hGIIA/AF647）处理细胞，发现无论是本身表达hGIIA的LNCaP和PC-3细胞（自分泌途径），还是不表达hGIIA的DU145细胞（旁分泌途径），都能在16小时内将细胞外的hGIIA内化到细胞内。当细胞同时暴露于hGIIA和c2时，c2会与hGIIA发生共定位，并竞争性地抑制hGIIA的内化。进一步的研究表明，hGIIA和c2都是通过先与细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）结合，然后通过细胞膜上的小窝结构（caveolae）进入细胞的。由于hGIIA的酶活性需要毫摩尔级别的钙离子，而研究人员发现内化的hGIIA所在的小窝区域内钙离子浓度极低，这为hGIIA在细胞内主要发挥非催化功能提供了有力证据。

hGIIA通过催化非依赖性机制促进类二十烷酸产生

类二十烷酸（如前列腺素E₂, PGE₂）是重要的炎症介质。实验发现，单独使用肿瘤坏死因子（TNF）或hGIIA对PGE₂的产生刺激有限，但两者联合则能显著增加LNCaP和PC-3细胞中的PGE₂产量。关键的是，使用催化失活的hGIIA突变体（H48Q）与TNF联合，也能产生类似的刺激效果，这明确证实了hGIIA的这一作用是独立于其酶活性的。同时，c2能够显著抑制由hGIIA+TNF所诱导的PGE₂增加。

hGIIA与表皮生长因子受体（EGFR）结合且该结合被c2抑制

那么，hGIIA是如何不依赖酶活来放大炎症信号的呢？研究人员将目光投向了EGFR。免疫共沉淀实验证实，在PC-3细胞中，hGIIA能够与EGFR直接结合，而预先用c2处理细胞，则会显著减少这种结合。分子对接模拟预测c2类似物可以结合在EGFR的配体结合域附近。在活细胞中，也观察到了外源hGIIA与EGFR及其内化调控蛋白Rab5的共定位。信号通路检测显示，hGIIA或其催化失活突变体H48Q都能激活EGFR、细胞外信号调节激酶（ERK）和胞质磷脂酶A₂-α（cPLA₂-α）的磷酸化。当c2与hGIIA+TNF共同处理细胞时，能够显著抑制pEGFR和pERK水平的升高。这些结果勾勒出一条清晰的通路：hGIIA通过结合EGFR，激活下游的ERK/cPLA₂-α通路，从而促进PGE₂的产生，而c2可以通过干扰hGIIA-EGFR的相互作用来抑制这一过程。

hGIIA在前列腺癌细胞中与波形蛋白结合

研究的另一大发现是hGIIA与中间丝蛋白波形蛋白（vimentin）的相互作用。免疫荧光显示内源的hGIIA与波形蛋白在LNCaP和PC-3细胞中存在共定位。通过高精度的荧光寿命成像（FLIM）和免疫共沉淀技术，研究人员首次在前列腺癌细胞中证实了hGIIA和波形蛋白之间存在直接的、距离小于10纳米的相互作用。体外结合实验进一步将结合区域定位在波形蛋白的卷曲螺旋2区（coil 2）。活细胞动态成像揭示，波形蛋白对hGIIA阳性囊泡的运输具有双重作用：一方面，它像“笼子”一样限制部分囊泡的运动，使其速度变慢、体积变小；另一方面，它又作为“支架”促进囊泡的融合和分裂，参与其主动运输。

c2阻断hGIIA/波形蛋白相互作用，调控波形蛋白细胞结构和hGIIA运输

c2是否能影响这一新发现的相互作用呢？体外酶免疫分析显示，c2能以IC₅₀为56.5 μM的效力抑制hGIIA与波形蛋白coil 2的结合，而传统的hGIIA酶活性抑制剂LY311727或波形蛋白抑制剂Withaferin A则无此效果。分子对接预测c2同样结合在波形蛋白的coil 2区域，可能通过空间位阻阻碍hGIIA的结合。在细胞实验中，c2处理导致细胞体积缩小，内源hGIIA和波形蛋白的荧光强度降低，并且波形蛋白网络所占细胞面积的比例下降，提示c2引起了波形蛋白的“成束”现象。更重要的是，c2极大地抑制了外源hGIIA在细胞内的运动，几乎使其停滞，并主要聚集在核周区域，同时改变了hGIIA囊泡的大小。为了明确波形蛋白在c2作用中的必要性，研究人员构建了波形蛋白敲除的DU145细胞。结果显示，在敲除细胞中，hGIIA的运动本身就已减慢，但c2仍能进一步抑制其运动。然而，c2增大hGIIA囊泡尺寸（提示可能诱导了聚集体aggresome形成）的效应在波形蛋白敲除细胞中完全消失。这表明c2抑制hGIIA运动是多模式的，但其调控囊泡大小的功能则特异性依赖于波形蛋白。

c2通过波形蛋白介导的途径启动前列腺癌细胞凋亡

最后，流式细胞术分析证实，c2处理72小时后，能显著增加PC-3、LNCaP和野生型DU145细胞的凋亡比例。然而，在波形蛋白敲除的DU145细胞中，c2则失去了诱导凋亡的能力。这直接证明了c2诱导前列腺癌细胞凋亡的功能是通过靶向波形蛋白实现的。

本研究揭示了一条hGIIA在前列腺癌中发挥促癌作用的新机制，该机制主要依赖于其非催化功能，即通过与EGFR和波形蛋白的相互作用，分别放大炎症信号和调控细胞内运输。研究人员成功开发了一类全新的hGIIA蛋白-蛋白相互作用抑制剂——环肽cF和c2。其中，c2展现出极高的效力（有效剂量低至0.1 mg/kg）和卓越的特性：口服生物利用度高、细胞渗透性强、在临床前模型中能有效抑制从雄激素敏感到去势抵抗乃至雄激素非依赖的各种前列腺癌的生长，甚至在部分动物中导致肿瘤消退，并且最重要的是，在严格的毒性评价中显示出极高的安全性。c2通过多模式发挥作用：一方面抑制hGIIA与EGFR的结合，从而阻断下游的促炎和促生存信号；另一方面，通过结合波形蛋白，扰乱hGIIA的细胞内运输，诱导聚集体形成和细胞凋亡。这项研究不仅为理解炎症与癌症的关联提供了新的分子视角，更重要的是，为治疗目前几乎无药可医的转移性去势抵抗性前列腺癌，提供了一种极具潜力的全新口服治疗策略，有望推动其进入临床试验阶段。