超级增强子驱动的LINC00973通过吸附miR-6756-3p稳定EN2促进头颈鳞癌进展

《Cell Death & Disease》：A novel super-enhancer-driven lncRNA LINC00973 governs head and neck squamous cell carcinoma progression through EN2

本研究揭示了头颈鳞癌（HNSCC）中一个由超级增强子（SE）驱动的LINC00973-miR-6756-3p-EN2调控轴。研究人员发现，转录因子FOSL1通过结合LINC00973的SE区域，招募BRD4和EP300，从而激活LINC00973的转录。LINC00973在细胞质中作为竞争性内源RNA（ceRNA）吸附miR-6756-3p，进而稳定EN2 mRNA并激活NOTCH信号通路，最终促进HNSCC的增殖、迁移和侵袭。该研究为HNSCC提供了新的预后标志物和潜在的治疗靶点。

　　

论文解读

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，尽管在手术、放疗、靶向治疗和免疫治疗方面取得了显著进展，但患者的长期生存率仍然不理想。因此，深入揭示HNSCC发生发展的分子机制，并寻找新的治疗靶点，是当前临床面临的迫切需求。

长链非编码RNA（lncRNA）作为一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子，在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。它们可以通过多种方式调控基因表达，其中一种经典机制是作为竞争性内源RNA（ceRNA），像“海绵”一样吸附微小RNA（miRNA），从而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，促进肿瘤的恶性进展。然而，在HNSCC中，许多lncRNA的具体功能和调控机制仍有待阐明。

另一方面，超级增强子（SE）作为一种特殊的顺式调控元件，是基因组上由多个增强子聚集形成的、富含H3K27ac、BRD4等转录共激活因子的区域。SE能够以极高的效率驱动关键基因的转录，在维持细胞身份和促进肿瘤发生中发挥核心作用。近年来，越来越多的证据表明，SE驱动的lncRNA过表达是多种癌症的共同特征，但这一机制在HNSCC中的作用尚不明确。

为了回答这些问题，南京医科大学附属口腔医院程杰教授和李瑾教授团队在《Cell Death & Disease》杂志上发表了一项研究。他们通过整合生物信息学、表观基因组学、转录组学分析以及细胞和动物模型实验，揭示了一个全新的SE驱动的LINC00973-miR-6756-3p-EN2调控轴，该轴在HNSCC的恶性进展中扮演着关键角色。

关键技术方法

本研究采用了多组学整合分析策略。研究人员首先利用TCGA、GEO等公共数据库和自建的50对HNSCC临床样本队列，进行生物信息学分析和临床相关性验证。在机制探索中，他们运用了RNA测序（RNA-seq）筛选下游靶点，通过RNA免疫共沉淀（RIP）和双荧光素酶报告基因实验验证了LINC00973与miR-6756-3p的直接结合。为了阐明上游调控机制，他们分析了H3K27ac ChIP-seq和HiChIP数据以鉴定超级增强子，并利用CRISPR干扰（CRISPRi）技术对增强子功能进行验证。此外，研究还通过体外细胞功能实验（CCK-8、Transwell等）和体内原位异种移植瘤模型，评估了LINC00973的促癌功能。

研究结果

1. LINC00973在HNSCC中异常高表达并与不良预后相关

研究人员首先通过分析TCGA-HNSC数据集，筛选出在HNSCC中高表达且具有预后价值的lncRNA，LINC00973是其中排名最靠前的候选分子。在多个独立队列和自建的50对HNSCC临床样本中，LINC00973的表达水平均显著高于癌旁正常组织，且其高表达与更晚的临床分期、更差的总体生存期（OS）和无进展生存期（PFI）显著相关。单细胞转录组数据分析显示，LINC00973主要富集在恶性上皮细胞中，提示其在肿瘤细胞中发挥核心作用。

2. LINC00973在体外和体内均促进HNSCC的恶性表型

为了探究LINC00973的生物学功能，研究人员在HNSCC细胞系中敲低了LINC00973的表达。功能实验表明，敲低LINC00973显著抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进了细胞凋亡和衰老。相反，过表达LINC00973则表现出相反的促癌效应。在动物实验中，稳定敲低LINC00973的HNSCC细胞形成的原位移植瘤体积更小，且颈部淋巴结转移率显著降低。这些结果共同证实了LINC00973在HNSCC中扮演着致癌基因的角色。

3. EN2被鉴定为LINC00973的关键下游效应因子

为了寻找LINC00973发挥作用的下游靶点，研究人员对敲低LINC00973的细胞进行了RNA测序分析。结果显示，转录因子Engrailed-2（EN2）是下调最显著的基因之一。进一步的实验证实，LINC00973的敲低或过表达能够分别降低或升高EN2的mRNA和蛋白水平。更重要的是，在敲低LINC00973的细胞中重新过表达EN2，能够有效逆转LINC00973敲低对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，并在动物模型中恢复了肿瘤的生长和淋巴结转移能力。这些结果确立了EN2是LINC00973发挥促癌功能的关键下游效应因子。

4. LINC00973通过吸附miR-6756-3p来稳定EN2 mRNA

鉴于LINC00973主要定位于细胞质，研究人员推测其可能通过ceRNA机制发挥作用。RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实LINC00973能够与AGO2蛋白结合，提示其具有吸附miRNA的能力。通过生物信息学预测和实验验证，研究人员发现miR-6756-3p能够同时与LINC00973和EN2的3'非翻译区（3'UTR）结合。双荧光素酶报告基因实验进一步证实了这种直接结合关系。机制上，LINC00973通过竞争性吸附miR-6756-3p，解除了miR-6756-3p对EN2 mRNA的降解作用，从而稳定了EN2 mRNA，最终促进了HNSCC的进展。

5. AP-1/FOSL1通过结合超级增强子激活LINC00973的转录

接下来，研究人员探究了LINC00973在HNSCC中异常高表达的上游机制。通过对H3K27ac ChIP-seq数据的分析，他们在LINC00973基因座附近发现了一个超级增强子（LINC00973-SE）。该区域富含H3K27ac、BRD4和EP300等SE标志性蛋白。利用SE抑制剂JQ1和NEO2734处理细胞，或通过CRISPRi技术特异性抑制该SE的活性，均能显著下调LINC00973的表达。进一步的基序分析发现，转录因子AP-1/FOSL1在LINC00973-SE区域高度富集。实验证实，FOSL1能够直接结合到LINC00973-SE上，并招募BRD4和RNA聚合酶II（RNA Pol II），从而共同激活LINC00973的转录。

6. EN2通过激活NOTCH信号通路促进HNSCC进展

最后，研究人员探索了EN2促进HNSCC进展的下游机制。基因集富集分析（GSEA）和RNA-seq数据均显示，EN2的敲低显著抑制了NOTCH信号通路的活性。在细胞实验中，EN2的过表达能够上调NOTCH1、N1ICD（NOTCH1胞内结构域）和HEY1等NOTCH通路关键分子的表达，并增强NOTCH1的转录活性。更重要的是，使用NOTCH通路抑制剂DAPT处理，能够有效逆转LINC00973过表达所诱导的促癌效应。在临床样本中，EN2与NOTCH1的表达也呈显著正相关。这些结果表明，EN2至少部分通过激活NOTCH信号通路来发挥其促癌作用。

结论与讨论

本研究系统性地揭示了一个全新的调控轴：在HNSCC中，转录因子FOSL1通过结合LINC00973基因座附近的超级增强子，招募BRD4和EP300等共激活因子，从而驱动LINC00973的转录。高表达的LINC00973在细胞质中作为ceRNA，竞争性吸附miR-6756-3p，解除了miR-6756-3p对其靶基因EN2 mRNA的抑制作用，导致EN2表达上调。EN2进而激活下游的NOTCH信号通路，最终促进了HNSCC的增殖、迁移、侵袭和淋巴结转移。

这项研究的意义在于：

1. 1.
   揭示了新的调控机制：首次阐明了超级增强子驱动的LINC00973在HNSCC中的致癌作用，并构建了从表观遗传调控到转录后调控的完整分子通路。
2. 2.
   提供了新的预后标志物：LINC00973、miR-6756-3p和EN2的表达水平与HNSCC患者的预后密切相关，有望成为评估患者预后的新型生物标志物。
3. 3.
   提出了新的治疗靶点：LINC00973-SE及其下游的LINC00973本身，为开发针对HNSCC的靶向治疗策略提供了新的潜在靶点。例如，靶向SE的抑制剂（如JQ1）在临床前模型中显示出良好的抗肿瘤效果，具有重要的转化潜力。

总之，这项研究不仅深化了我们对HNSCC发病机制的理解，也为该疾病的诊断和治疗提供了新的思路和理论依据。