LENT通过结合DHX36调控翻译并抑制自噬在黑色素瘤中的作用机制

《Cell Death & Disease》：Interaction of lncRNA LENT with DHX36 regulates translation and suppresses autophagy in melanoma

本研究针对黑色素瘤细胞中长链非编码RNA（lncRNA）的调控机制展开研究。研究人员发现MITF调控的lncRNA LENT（LINC00520）通过与G4四链体解旋酶DHX36相互作用，调控内质网和线粒体稳态相关mRNA的翻译过程，从而抑制自噬/线粒体自噬，促进黑色素瘤细胞存活。该研究揭示了LENT-DHX36轴在维持黑色素瘤细胞氧化磷酸化代谢中的关键作用，为开发靶向lncRNA的黑色素瘤治疗策略提供了新思路。

　　

在黑色素瘤研究领域，肿瘤细胞的异质性和治疗抵抗一直是困扰临床治疗的难题。黑色素瘤细胞存在多种状态，其中分化程度较高的黑色素细胞样（melanocytic）细胞状态由MITF（Microphthalmia-associated transcription factor）和SOX10等转录因子驱动，而间充质样（mesenchymal）细胞状态则与治疗抵抗密切相关。近年来研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）在黑色素瘤发生发展中发挥重要作用，如SAMMSON和LENOX等lncRNA被证实通过调控线粒体功能影响黑色素瘤细胞存活。然而，MITF调控的lncRNA网络及其作用机制仍有待深入探索。

本研究聚焦于MITF调控的新型lncRNA LENT（LINC00520），探究其在黑色素瘤中的表达特征、分子机制及功能意义。研究人员通过整合MITF和SOX10的ChIP-seq数据以及RNA-seq数据，发现LENT在黑色素细胞样黑色素瘤中高表达，且其表达受MITF直接调控。临床数据分析显示，LENT在转移性黑色素瘤中高表达与患者不良预后相关。

为阐明LENT的功能，研究团队采用了多种技术方法，包括CRISPR干扰（CRISPRi）、反义寡核苷酸（ASO）基因沉默、异种移植瘤模型、蛋白质组学、免疫共沉淀（Co-IP）、电泳迁移率实验（EMSA）、多核糖体分析（polysome profiling）和电子显微镜等关键技术。研究还利用了TCGA-SKCM队列数据和单细胞RNA测序数据进行分析。

LENT在黑色素细胞样黑色素瘤中高表达并与患者预后相关

通过分析TCGA数据库和单细胞RNA测序数据，研究人员发现LENT主要在黑色素细胞样黑色素瘤细胞中表达，而在间充质样细胞中表达较低。RNA原位杂交（RNAscope）证实LENT定位于细胞质，在黑色素瘤患者组织标本中可检测到其表达。生存分析显示，在转移性黑色素瘤中，LENT高表达与患者较差预后相关。

LENT是黑色素瘤细胞增殖和存活所必需的

功能实验表明，通过CRISPRi、ASO或shRNA沉默LENT表达，可显著抑制黑色素细胞样黑色素瘤细胞的增殖并诱导凋亡，而对不表达LENT的细胞无影响。在异种移植瘤模型中，LENT ASO处理可显著抑制肿瘤生长。有趣的是，LENT与LENOX、SAMMSON的联合靶向具有协同促凋亡效应，提示这些MITF调控的lncRNA网络共同维持黑色素瘤细胞存活。

LENT与G4解旋酶DHX36直接相互作用

为探究LENT的作用机制，研究人员通过RNA pulldown联合质谱分析发现DHX36是LENT的主要结合蛋白。DHX36是一种G-四链体（G-quadruplex, G4）解旋酶，可解开RNA中的G4结构促进翻译。免疫共沉淀实验在天然和UV交联条件下均验证了LENT与DHX36的结合。体外EMSA实验进一步证实LENT与纯化的DHX36蛋白直接相互作用，且该相互作用部分依赖于LENT中潜在的G4形成序列。

LENT调控DHX36与mRNA的结合及翻译进程

DHX36 RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）显示，DHX36与近2000种转录本结合，这些mRNA富集于线粒体功能相关通路。LENT沉默可改变484种mRNA与DHX36的结合能力。多核糖体分析发现，LENT沉默特异性地减少了383种mRNA与轻多核糖体（light polysome）的结合，这些mRNA主要编码内质网（ER）稳态、蛋白糖基化、抗原呈递等相关蛋白。相反，一些mRNA（如NOX4、RBPJ）与多核糖体的结合增加。蛋白质水平检测证实，LENT通过调控这些mRNA的翻译影响相应蛋白表达。

LENT和DHX36定位于线粒体并调控线粒体功能

免疫荧光和亚细胞分级实验显示，DHX36和LENT均富集于线粒体。免疫电镜进一步证实DHX36定位于线粒体内。LENT沉默诱导线粒体自噬（mitophagy），表现为自噬体增多、LC3-II积累、线粒体-溶酶体接触增加。Seahorse分析显示LENT沉默降低最大耗氧率和储备容量，导致活性氧（ROS）积累和DNA损伤反应激活。

LENT沉默引起氧化磷酸化蛋白异常积累和蛋白毒性应激

令人意外的是，尽管线粒体功能受损，LENT沉默细胞中多种氧化磷酸化（OxPhos）蛋白（如ATP5A、UQCR2、SDHB等）却异常积累。免疫荧光发现这些蛋白错误定位至细胞质和细胞核。这种蛋白错误定位可能引发蛋白毒性应激（proteotoxic stress），最终导致细胞凋亡。

本研究系统阐明了LENT通过结合DHX36调控特定mRNA翻译，维持内质网和线粒体稳态，抑制自噬/线粒体自噬，从而促进黑色素瘤细胞存活的新机制。研究发现LENT-DHX36轴精细调控一系列编码ER稳态、线粒体功能和自噬相关蛋白的mRNA的翻译进程，这一发现不仅深化了对lncRNA调控翻译机制的理解，也为黑色素瘤治疗提供了新的潜在靶点。与之前发现的SAMMSON、LENOX等lncRNA类似，LENT代表了一类通过优化线粒体功能促进黑色素瘤细胞存活的关键调控分子，针对这些lncRNA的联合靶向策略可能为克服黑色素瘤治疗抵抗提供新途径。

该研究的创新性在于首次揭示了LENT-DHX36轴在调控翻译和抑制自噬中的关键作用，并阐明了其在黑色素瘤细胞维持氧化磷酸化代谢中的重要意义。研究结果发表于《Cell Death & Disease》期刊，为理解lncRNA在肿瘤代谢调控中的作用提供了重要证据，也为开发靶向lncRNA的黑色素瘤治疗策略奠定了理论基础。