CAMK1D通过激活AMPK/PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药

《Cell Death & Disease》：CAMK1D activates AMPK/PINK1/Parkin-dependent mitophagy to promote enzalutamide resistance in prostate cancer

本研究针对前列腺癌患者对恩杂鲁胺产生耐药性的临床难题，揭示了CAMK1D通过激活AMPK/PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬促进前列腺癌干细胞富集的新机制。研究人员开发了靶向CD44的纳米递送系统siCAM/HLNP，有效逆转耐药并抑制肿瘤生长，为克服前列腺癌治疗耐药提供了新的策略和靶点。

　　

前列腺癌是男性中第二常见的恶性肿瘤，尽管雄激素受体靶向药物如恩杂鲁胺能初期改善患者预后，但耐药性几乎不可避免地发生，这成为临床治疗的主要挑战。越来越多的证据表明，前列腺癌干细胞样细胞是导致恩杂鲁胺耐药的关键因素。这些细胞具有自我更新、多向分化和治疗抵抗的能力，是肿瘤复发和进展的根源。然而，前列腺癌干细胞维持与恩杂鲁胺耐药之间的具体分子联系尚未完全阐明。

为了解决这一难题，研究人员在《Cell Death & Disease》上发表了最新研究成果，揭示了钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶1D（CAMK1D）在前列腺癌干细胞介导的恩杂鲁胺耐药中的关键作用。研究发现，CAMK1D在恩杂鲁胺耐药的前列腺癌中持续上调，通过增强线粒体自噬促进耐药性。机制上，CAMK1D通过激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）/PINK1信号通路来增强线粒体自噬，从而支持前列腺癌干细胞的扩张。研究人员还开发了一种靶向CAMK1D的CD44导向纳米颗粒（siCAM/HLNP），在临床前模型中有效逆转了恩杂鲁胺耐药。

为开展这项研究，团队运用了多种关键技术方法。研究纳入了226例前列腺癌患者的临床样本进行免疫组化分析。建立了恩杂鲁胺耐药的细胞系模型（LR和CR）和小鼠异种移植模型。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了肿瘤细胞的异质性。利用蛋白质印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）和体外激酶实验验证了CAMK1D与AMPK的直接相互作用及其磷酸化活性。通过透射电子显微镜（TEM）观察了线粒体自噬的超微结构。使用肿瘤球形成实验、极限稀释实验和流式细胞术评估了干细胞特性。最后，开发了CD44靶向的脂质聚合物纳米颗粒（siCAM/HLNP）用于体内治疗研究。

CAMK1D-high干细胞样细胞在恩杂鲁胺耐药前列腺癌中的富集

通过建立RM-1小鼠前列腺癌同种移植模型并进行单细胞RNA测序分析，研究人员发现恩杂鲁胺处理的肿瘤中富含一个干细胞样细胞簇。该簇高表达与治疗抵抗和自我更新相关的基因。进一步分析将这一簇的前500个上调基因与公共恩杂鲁胺耐药数据集交叉比对，鉴定出CAMK1D是最显著上调的基因之一。CAMK1D与经典干细胞标志物（如CD44、CD133、SOX2）在多组数据集中呈现强共表达。在已建立的恩杂鲁胺耐药细胞系（LR和CR）中，干细胞标志物在mRNA和蛋白水平均升高。使用CD44分选出的前列腺癌干细胞（PCSCs）表现出更高的CAMK1D表达。对184例原发性前列腺癌和42例去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者组织的临床分析显示，CAMK1D在CRPC中表达显著更高，且其过表达与较短的无病生存期相关。这些结果共同表明CAMK1D与前列腺癌的干细胞样特性密切相关。

CAMK1D维持恩杂鲁胺耐药细胞的干细胞样表型

研究人员通过功能实验验证了CAMK1D对维持干细胞特性的必要性。利用小干扰RNA（siRNA）、短发夹RNA（shRNA）和单引导RNA（sgRNA）均能有效敲低CAMK1D的表达。CAMK1D敲低显著降低了干细胞标志物（如CD44和CD133）的表达，而其过表达则上调了这些标志物。功能上，CAMK1D敲除显著损害了克隆形成潜能，表现为肿瘤球数量减少，而过表达则增强了这一能力。CAMK1D沉默的细胞表现出全克隆形成能力（holoclone formation，体外干细胞行为的标志）降低。体内极限稀释实验进一步证实，CAMK1D沉默显著抑制了CR球形成细胞的肿瘤起始能力。此外，sgCAMK1D组的肿瘤中CD44和SOX2水平显著降低。这些数据表明CAMK1D在体外和体内均能维持前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞的干细胞样特性并促进肿瘤发生。

CAMK1D通过扩增干细胞样细胞群促进恩杂鲁胺耐药

研究人员通过功能获得和功能缺失实验探究CAMK1D诱导的干细胞样表型是否影响恩杂鲁胺反应。CAMK1D敲低增强了耐药细胞对恩杂鲁胺的敏感性，而其过表达则增加了亲本细胞的耐药性。克隆形成生存实验结合CD44免疫荧光染色显示，在恩杂鲁胺处理下，CAMK1D过表达组中CD44阳性细胞显著扩增，流式细胞术也证实了这一点。值得注意的是，CD44阳性细胞的恩杂鲁胺半数抑制浓度（IC₅₀）值更高。CAMK1D还增强了恩杂鲁胺耐药细胞的增殖能力。沉默CAMK1D增强了恩杂鲁胺对前列腺癌细胞的抑制作用，而过表达则减弱了此效应。同时，在恩杂鲁胺处理下，敲低CAMK1D抑制了LR和CR细胞的集落形成和侵袭潜力。在体内模型中，抑制CR异种移植瘤中的CAMK1D显著减少了肿瘤生长。免疫组化显示CAMK1D沉默的肿瘤中Ki67阳性率降低，蛋白质印迹显示CD44表达下降。更重要的是，低表达CAMK1D的小鼠生存期显著延长。这些结果表明CAMK1D通过扩增前列腺癌中的干细胞样群体促进恩杂鲁胺耐药的发展。

CAMK1D增强前列腺癌干细胞中的线粒体自噬

为了阐明前列腺癌干细胞的代谢特征，研究人员对单细胞RNA测序数据中前列腺癌干细胞簇上调的基因进行了基因集富集分析（GSEA），结果显示AKT和AMPK信号通路、氧化磷酸化和线粒体自噬相关过程显著富集。免疫荧光分析显示CAMK1D在前列腺癌干细胞中与线粒体共定位。透射电子显微镜超微结构分析揭示，与非前列腺癌干细胞相比，前列腺癌干细胞中线粒体自噬空泡数量显著增加，线粒体嵴数量减少，突出了干细胞群中增强的线粒体自噬活性。在非前列腺癌干细胞中过表达CAMK1D导致线粒体自噬结构显著增加，线粒体膜电位（通过JC-1染色评估）显著降低。同样，在线粒体自噬诱导剂寡霉素/抗霉素A（OA）处理下，CAMK1D敲低导致CR前列腺癌干细胞出现类似的线粒体自噬改变。在CR前列腺癌干细胞中，OA处理显著增加了p-AMPK、PINK1、干细胞标志物SOX2和CD44以及自噬标志物Beclin1和SQSTM1/p62的水平，而这些蛋白变化在同时沉默CAMK1D后被减弱。此外，OA刺激诱导了前列腺癌干细胞中线粒体和溶酶体的共定位，此效应在CAMK1D敲低后被消除。蛋白质印迹分析证实，CAMK1D介导的线粒体自噬调控增加了线粒体自噬相关蛋白（包括Beclin1和LC3B）的表达，下调了SQSTM1/p62的表达。CAMK1D沉默降低了线粒体自噬相关蛋白的表达，而其过表达则增强了这些蛋白的表达。这些结果表明CAMK1D促进前列腺癌干细胞中的线粒体自噬，特别是在OA刺激下，从而有助于维持其干细胞样特性。

线粒体自噬抑制剂逆转CAMK1D诱导的干细胞样表型和恩杂鲁胺耐药

为了进一步确认线粒体自噬在CAMK1D介导的恩杂鲁胺耐药中的作用，研究人员探讨了药理学抑制线粒体自噬是否能逆转CAMK1D过表达的影响。使用Mdivi-1（一种选择性线粒体自噬抑制剂，可阻断线粒体分裂和随后的线粒体自噬）证明，抑制线粒体自噬有效减弱了CAMK1D过表达在前列腺癌细胞中诱导的肿瘤球形成增加。类似地，CAMK1D诱导的肿瘤起始能力增强也被逆转，体外极限稀释实验证明了这一点。体内极限稀释实验显示，在药理学抑制线粒体自噬后，CAMK1D过表达细胞的肿瘤起始能力显著降低。一致地，集落形成实验表明，CAMK1D驱动的增强的克隆形成潜力也被线粒体自噬抑制剂显著抑制。值得注意的是，线粒体自噬抑制恢复了CAMK1D过表达细胞对恩杂鲁胺的敏感性，表现为IC₅₀值降低。蛋白质印迹分析进一步显示，CAMK1D诱导的CD44表达增加在线粒体自噬抑制后被消除。这些发现在异种移植模型中得到证实，暴露于线粒体自噬抑制剂的肿瘤组织表现出CD44和其他干细胞相关标志物表达降低。这些发现表明线粒体自噬对于CAMK1D诱导的前列腺癌干细胞样特征和治疗耐药是不可或缺的。

CAMK1D以激酶活性依赖性方式通过激活AMPK/PINK1信号通路增强线粒体自噬

近期研究强调了AMPK在维护线粒体完整性方面的基本且进化上保守的功能。新证据表明，几个新发现的AMPK下游靶标在线粒体稳态的多个方面，特别是在线粒体自噬的调控中至关重要。单细胞RNA测序分析显示AMPK信号在前列腺癌干细胞中富集，提示其在线粒体自噬和干性维持中的作用。后续验证实验显示，在恩杂鲁胺耐药细胞中，磷酸化AMPK和PINK1在前列腺癌干细胞中相对于非干细胞显著上调。值得注意的是，敲低CAMK1D显著降低了它们的表达。此外，OA处理增加了线粒体自噬相关标志物（包括PINK1、Parkin、Beclin1和SQSTM1/p62）的水平，但此效应在CAMK1D沉默后显著减弱。一致地，CAMK1D过表达增加了线粒体自噬相关蛋白（LC3B和PINK1）的水平，而AMPK敲低则消除了这些效应，表明CAMK1D通过AMPK促进线粒体自噬。免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验证明了CAMK1D与AMPK之间存在相互作用，GST pull-down实验进一步确认了两者直接相互作用。体外激酶实验揭示CAMK1D直接在Thr172位点磷酸化AMPK。磷酸模拟AMPK突变体（T172D）逆转了CAMK1D敲低诱导的PINK1和p-Parkin表达减少，而显性负性AMPK突变体（T172A）未产生显著变化。这些数据共同确立了AMPK磷酸化在CAMK1D介导的线粒体自噬中的关键作用。功能实验显示，CAMK1D的催化结构域突变体未能激活AMPK磷酸化，并且无法诱导LC3B或CD44等干性相关标志物的变化。重要的是，这些突变体对肿瘤球形成、恩杂鲁胺敏感性、集落形成或线粒体自噬没有显著影响。这些结果表明CAMK1D通过激活AMPK/PINK1依赖性线粒体自噬通路增强前列腺癌干性，且其激酶活性对此功能至关重要。

通过CD44纳米颗粒靶向递送siCAMK1D和恩杂鲁胺在临床前模型中抑制恩杂鲁胺耐药前列腺癌生长

CD44在多种肿瘤的癌症干细胞中广泛表达，其可成药的细胞外结构域使其成为有前景的临床治疗靶点。为了评估靶向CAMK1D-high前列腺癌干细胞在恩杂鲁胺耐药中的治疗潜力，研究人员开发了用于递送siCAMK1D的HLNP纳米颗粒。该纳米颗粒设计通过CD44识别选择性结合前列腺癌干细胞，增强对干细胞样肿瘤亚群递送的特异性。透射电子显微镜显示siCAM/HLNP呈典型球状结构，平均粒径为125.2±2.3纳米。在不同质量比下自组装产生稳定的siCAM/HLNP构建体，琼脂糖凝胶电泳证实siRNA在比例高于20:1时能稳定结合LNP。与siCAM/LNP处理相比，用siCAM/HLNP处理的CR和RM-1细胞在孵育4小时后Cy3和FITC信号显著更高，表明CD44靶向增强了细胞摄取。蛋白质印迹分析证实siCAMK1D能有效沉默小鼠RM-1和人类恩杂鲁胺耐药细胞中的CAMK1D表达，验证了纳米平台的递送效率。

为了评估体内抗肿瘤疗效，研究人员使用RM-1细胞建立了原位前列腺癌模型。体内成像显示Enz-siCAM/HLNP组随时间推移肿瘤负荷减少最显著。肿瘤组织的组织学分析显示联合治疗组肿瘤大小和细胞增殖（Ki67）显著降低。TUNEL和CD44免疫荧光染色显示治疗后细胞凋亡增加，前列腺癌干细胞群显著减少，这转化为总生存期的显著延长。肿瘤裂解液的蛋白质印迹分析证实了CAMK1D和CD44表达的下调。值得注意的是，未检测到脑损伤或神经功能障碍，突出了该治疗方法的良好安全性。此外，纳米平台的治疗效果在患者来源的前列腺癌类器官中得到验证，治疗显著降低了线粒体自噬水平并抑制了类器官生长。这些发现表明，通过CD44导向的纳米平台共同递送siCAMK1D和恩杂鲁胺能通过消除前列腺癌干细胞和破坏线粒体自噬来有效根除恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞。

本研究确立了CAMK1D作为恩杂鲁胺耐药前列腺癌干细胞维持和治疗耐药的关键调控因子。机制上，CAMK1D通过激活AMPK/PINK1信号通路促进线粒体清除，从而支持治疗耐药前列腺癌干细胞的存活和维持。从治疗角度看，研究人员证明CD44靶向的纳米平台递送siCAMK1D能有效消除前列腺癌干细胞，逆转恩杂鲁胺耐药，并在多个临床前模型中抑制肿瘤进展。这些发现为靶向CAMK1D介导的代谢适应以治疗晚期前列腺癌提供了机制见解和转化依据。该研究不仅深化了对前列腺癌干细胞耐药机制的理解，而且开发了一种有前景的纳米治疗策略，为克服临床恩杂鲁胺耐药提供了新的思路和方法。