《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Production and characterization of norovirus virus-like particles vaccine candidates in a genetically modified
Ogataea minuta system
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诺如病毒GII.4 VP1蛋白通过低甲醇喂养的O. minuta双突变株实现胞内表达并纯化，获得13.4 mg高纯度蛋白。电镜证实其形成的VLPs结构稳定，ELISA显示强抗原性及与血型抗原特异性结合。动物实验表明肌肉注射诱导系统IgG，鼻/舌下黏膜途径诱导IgG、IgA及黏膜IgA，脂质A佐剂显著增强免疫应答。
津田雅志（Masashi Tsuda）| 中谷由纪（Yuki Nakatani）| 长谷智（Satoshi Baba）| 吉田久美（Kumi Yoshida）| 索梅谷和彦（Kazuhiko Someya）| 小寺良国（Yoshikuni Onodera）| 野中幸一（Koichi Nonaka）| 千叶康則（Yasunori Chiba）
第一三共株式会社生物技术研究实验室1部，日本群马县千代田市370-0503
开发针对诺如病毒的有效疫苗仍然是公共卫生领域的重点任务。诺如病毒GII.4型的衣壳蛋白VP1作为一种有前景的疫苗候选物，是通过甲基营养酵母Ogataea minuta的生产系统制备的。该蛋白在细胞内表达后，通过固定化金属亲和层析和阴离子交换层析进行纯化，从50毫升培养上清液中获得了13.4毫克的纯化VP1蛋白。通过透射电子显微镜确认，基于VP1的病毒样颗粒（VLPs）在冻融后仍能保持其结构。以VLPs形式纯化的VP1蛋白表现出强烈的抗原性，并且能够特异性地与组织血型抗原结合，这一结果通过酶联免疫吸附测定（ELISA）得到验证。在BALB/c小鼠中的免疫原性研究表明，肌肉注射所有测试剂量均能诱导出强烈的血清IgG反应，且没有明显的剂量依赖性差异。此外，鼻内或舌下黏膜给药还能诱导全身性IgG、IgA和黏膜IgA反应。脂质A佐剂显著增强了这些免疫反应。这些发现表明O. minuta生产系统能够生产出具有免疫原性的诺如病毒VLPs作为疫苗候选物。
章节摘录
酵母菌株和培养基
所有使用的菌株均来源于
O. minuta tat10113（16）。将质粒pOMEA-Z1/aF-VP1或pOMEA-Z1/VP1导入tat10113中，以生产诺如病毒VLPs的VP1亚单位蛋白。这些质粒含有编码VP1蛋白的核苷酸序列，该序列基于GenBank中登录号为
BAQ55213.1的氨基酸序列合成。质粒pOU1/PDER-PKA（12）也被引入重组菌株中，以共同表达伴侣蛋白Pdi1和Ero1。
利用O. minuta异源蛋白生产系统表达VP1蛋白
为了获得高产VP1蛋白的菌株，我们使用了O. minuta的双突变菌株，该菌株的酒精氧化酶1基因（AOX1）和Prb1蛋白酶基因（PRB1）均被破坏。我们之前的研究表明，在低甲醇喂养条件下，这种双突变酵母系统能够提高异源蛋白的生产效率（16,17）。VP1蛋白的生产菌株按照“材料与方法”部分中的描述进行培养和生成。
讨论
在本研究中，我们成功利用O. minuta prb1 aox1Δ双突变菌株在低甲醇条件下实现了诺如病毒VP1蛋白的细胞内生产。尽管有报道称K.phaffii可以分泌VP1蛋白（12），但我们尝试通过酵母分泌系统添加α因子信号序列进行生产时效果不佳（见图S1）。由于所生产的VP1蛋白保留了α因子信号序列但缺乏糖基化修饰
CRediT作者贡献声明
津田雅志（Masashi Tsuda）：撰写初稿、数据可视化、实验研究、数据分析、概念构建。中谷由纪（Yuki Nakatani）：资源获取、实验协助。长谷智（Satoshi Baba）：研究指导、概念构思。吉田久美（Kumi Yoshida）：撰写内容、审稿与编辑。索梅谷和彦（Kazuhiko Someya）：撰写内容、审稿与编辑。小寺良国（Yoshikuni Onodera）：撰写内容、审稿与编辑。野中幸一（Koichi Nonaka）：撰写内容、审稿与编辑、研究指导、概念构思。千叶康則（Yasunori Chiba）：撰写内容、审稿与编辑、研究指导。
致谢
本研究未获得任何资助。津田雅志、中谷由纪、长谷智、吉田久美、索梅谷和彦和野中幸一均为第一三共株式会社的员工。
