利用高速逆流色谱和高分辨率质谱技术，基于pH值对Beta vulgaris L.中的皂苷进行分离与鉴定

《Journal of Chromatography A》：pH-dependent separation and identification of saponins from Beta vulgaris L. using high-speed countercurrent chromatography and high-resolution mass spectrometry

甜菜根（Beta vulgaris L. cv. Cylindra）皂苷通过pH可调HSCCC-UHPLC-HRMS/MS联用技术分离鉴定，发现pH显著影响分离行为，糖基取代类型及二醇烷结构影响保留特性，鉴定47种皂苷（含新化合物nодержagenin），总含量7.2g/kg干提取，高于其他品种。

　　
红甜菜根（Beta vulgaris L. cv. Cylindra）皂苷的分离与鉴定研究

摘要部分揭示了该研究的核心创新点：通过pH可调节的高速逆流色谱（HSCCC）结合超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS/MS），系统解析了红甜菜根根部的皂苷组成。研究团队开发了新型溶剂系统（1-丁醇: 丙酮: 乙腈: 柠檬酸磷酸缓冲液，体积比1:0.1:0.05:0.8），在pH3-7范围内实现了对离子化特性差异显著的多糖基皂苷的高效分离。特别值得注意的是，通过对比不同pH条件下的分离效果，发现糖链取代基的位置、数量及糖苷键类型对化合物保留行为具有决定性影响。研究成功鉴定了47种皂苷，其中包含首次报道的aglycone型化合物norhederagenin（分子量455.31），这显著扩展了传统认为的甜菜皂苷结构谱系。

在引言部分，研究背景着重强调了红甜菜根作为功能食品的潜力。已有文献证实其含有 betalains（色素类化合物）、酚类、胡萝卜素、硝酸盐等活性成分，但皂苷类成分的系统研究仍存在空白。特别指出传统提取方法（甲醇-水或乙醇-水体系）在分离复杂皂苷混合物时存在局限性，主要源于同系物结构相似性导致的色谱分辨率不足。

方法学创新体现在三个方面：首先，HSCCC工艺采用离心力场维持两相系统稳定，有效解决了极性溶剂（如水）难以形成均相分配的问题；其次，开发pH动态调节系统，通过缓冲液（柠檬酸-磷酸）实现pH3-7连续调节，观察到pH对皂苷保留值的影响系数高达±0.35；最后，结合UHPLC（超高效液相色谱）与高分辨质谱（精度＞5ppm），实现了分子式精确测定和糖基取代模式的解析。

实验数据显示，红甜菜Cylindra品种根中总皂苷含量达到7.2克/千克干提取物，较其他栽培品种（如德国品种Amazone）高出40%-60%。在分离行为方面，观察到三个显著规律：1）糖基数目与极性呈正相关，三糖基皂苷较单糖基延迟洗脱；2）末位糖基类型影响保留时间，六碳糖（Hex）末位皂苷比五碳糖（Pen）晚洗脱约15分钟；3）二氧戊环结构（Diox）皂苷在pH7时出现同分异构体分离，而在pH3时则合并为单一峰，这为皂苷构效关系研究提供了新视角。

质谱分析发现，norhederagenin（分子量455.31）与已知化合物hederagenin（471.34）在分子式层面存在差异，其结构特征表现为独特的五元环取代基。通过NMR验证显示，该化合物具有特征性的δ3.2（1H，s，C3-OH）和δ5.1（1H，d，J=8.5Hz，C20-H）信号峰，证实了其新型皂苷骨架的化学结构。

工艺优化方面，实验团队通过正交实验法确定了最佳分离参数组合。当pH=5时，系统分离效率达到峰值（Rf值标准差＜0.08），此时β vulgaroside IV（含量占比23.7%）与β vulgaroside III（含量占比18.9%）的分离度可达1.8。而pH=7时，二氧戊环型皂苷的分离度提升至2.3，这为后续功能活性研究提供了结构均一性保障。

应用价值方面，研究证实高pH（>6）条件下分离的皂苷组分具有更强的抗氧化活性（ORAC值提升42%），这可能与其糖基的乙酰化程度相关。同时，分离纯化后的单糖基皂苷（如Hex-O-akg）显示出显著的抗肿瘤活性（IC50值＜5μM），这为开发新型抗癌药物提供了候选化合物。

研究局限性部分指出，目前仅对单糖取代的皂苷进行了系统分离，对于多糖基复合皂苷（如Hex-Pen-Act型）的分离效率仍有提升空间。建议后续研究可尝试引入离子液体作为固定相，以增强对高盐度皂苷的吸附能力。

该研究在方法学层面实现了突破：1）建立了pH梯度调控的逆流色谱新范式，2）开发了适用于糖基皂苷的溶剂筛选算法（基于正相分配系数与糖链疏水性匹配度），3）首次将二维质谱（MS/MS与HRMS联用）应用于皂苷糖基的定量分析，准确度达到99.5%。

在产业化应用方面，研究团队通过工艺放大实验（从实验室规模0.5L提升至50L中试），发现当流速从1mL/min增至5mL/min时，分离纯度保持稳定（RSD＜5%）。特别开发的缓冲液循环使用系统，使溶剂回收率达到82%，符合绿色化学原则。

该成果对植物化学领域具有重要启示：1）皂苷的分离机制与糖基取代模式存在显著相关性，2）pH调节可调控皂苷的离子化程度，从而影响其在两相系统中的分配系数，3）建立"分离-鉴定-活性"一体化平台，为天然产物开发提供新思路。

研究团队特别强调数据共享机制：所有分离得到的皂苷标准品（含11种已报道化合物）和质谱数据已上传至植物化学数据库PhytoBank（访问权限需通过机构申请），为后续研究提供了公共数据基础。

利益冲突声明部分披露，研究团队持有两种新型皂苷的专利（专利号P.448204和P.2023-00567），其中norhederagenin已进入中试生产阶段。该专利涉及一种基于pH梯度分离的连续逆流色谱技术，已获得欧盟食品医药管理局（EFSA）的工艺创新认证。

在质量控制方面，研究建立了三重验证体系：1）HSCCC分离后通过NMR确认结构；2）HRMS精确测定分子量（误差＜2ppm）；3）液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）实现糖基取代模式的精确解析。这种多维度验证方法将皂苷鉴定准确率提升至99.2%。

该研究首次系统揭示了甜菜根皂苷的构效关系：1）糖基数目与皂苷的表面活性呈正相关，三糖基皂苷（如Hex-Hex-Hex-O-akg）的临界胶束浓度（CMC）较单糖基降低约30%；2）二氧戊环结构（Diox）使皂苷的脂溶性增强，在pH>5时更易保留在固定相；3）末位糖基的羟基化程度影响其水溶性，乙酰化处理可使皂苷的溶解度降低40%-60%。

在功能评价部分，体外实验显示分离得到的皂苷组合（如β vulgaroside IV:III=2:1）可显著提升红细胞膜流动性（从12.3%提升至19.8%），且这种效应在pH5条件下最显著。体内实验进一步证实，该皂苷组合可使高脂饮食小鼠的LDL-C水平降低28.6%，提示其在心血管疾病预防中的应用潜力。

该研究对农业经济产生实际影响：通过优化Cylindra品种的种植条件（如pH5.8的土壤环境），可使皂苷总产量提高至7.8g/kg干重，较传统品种提升37%。同时，开发的多功能提取工艺（溶剂回收率＞85%）使生产成本降低42%。

未来研究方向部分提出三个重点：1）开发基于微流控的HSCCC系统，实现微克级样品的分离；2）建立皂苷糖基取代模式的预测模型；3）探索皂苷在光催化降解污染物中的应用潜力。研究团队已与德国BASF公司达成合作意向，共同推进皂苷基材料的工业化生产。

该成果被《Journal of Agricultural and Food Chemistry》选为封面文章，评审专家特别指出其"在复杂皂苷体系的分离与鉴定方面取得了突破性进展，为天然产物研究提供了新的方法论"。目前，该技术已应用于5个欧盟有机农场，实现皂苷含量≥8.5g/kg的绿色生产工艺。

在环境效益方面，研究采用生物降解溶剂体系（1-丁醇生物降解周期＜28天），相比传统氯代溶剂（如氯仿）的环境风险降低92%。经OECD 301F测试，该工艺的溶剂残留量＜0.5ppm，符合欧盟有机食品标准。

总之，该研究不仅填补了甜菜根皂苷系统研究的空白，更在分离技术、结构鉴定和产业化应用三个层面实现了创新突破，为功能性食品开发和天然产物药物研究提供了重要技术支撑。其建立的pH梯度逆流色谱技术已被国际同行引用（截至2024年3月，被引次数达47次），成为复杂皂苷分离的典范方法。