用于通过光合作用驱动在烟草中合成透明质酸的质体工程

《Plant Biotechnology Journal》：Plastid Engineering for Photosynthesis-Driven Synthesis of Hyaluronic Acid in Tobacco

本研究利用烟草叶绿体基因组工程表达 Streptococcus equi 的五个基因构建 HA 合成路径，发现异养条件下 AL7WT 线系高效积累透明质酸（HA），而自养条件下积累显著降低。质谱分析表明自养生长导致 HA 合成关键酶 HasA 表达下降，并伴随 CBB 循环中间体 F6P、G6P、UDP-Glc 的耗竭，揭示代谢限制是主要瓶颈。

　　
本研究聚焦于通过叶绿体基因组工程在烟草中实现透明质酸（HA）的光自养合成，并系统解析了该过程对植物生理及代谢的影响。研究团队构建了包含五个关键基因（glmS、glmM、glmU、hasB、hasA）的合成 operon，通过不同的表达调控策略（T7 RNA聚合酶诱导型、psbA核糖体结合位点驱动型、低泄漏表达型）导入烟草叶绿体基因组，成功获得多个稳定遗传的转植株系。

在表型分析中发现，高表达组（AL8WT和AL7T7pol）普遍存在生长迟滞、叶绿素合成障碍及早期组织坏死现象。其中AL7T7pol株系在光自养条件下无法存活，而AL8WT株系虽能开花但无法产生抗性种子。值得注意的是，低泄漏表达的AL7WT株系虽呈现轻度叶色苍白和生长延迟，但仍能完成全生命周期发育并产生抗性种子。这种差异表明，叶绿体HA合成路径的表达强度与植物耐受性直接相关。

代谢组学分析揭示了关键中间体的动态平衡：异养条件下外源补充的葡萄糖显著缓解了UDP-Glc的竞争性消耗，使得HA合成酶（hasA）的表达量提升37%-52%，对应的HA产量达到60 μg/g FW。而光自养条件下，尽管CBB循环持续产生F6P，但UDP-Glc的合成受阻，导致hasA蛋白积累量下降至对照组的15%-20%，同时检测到G6P和UDP-Glc的浓度分别降低28%和19%（p<0.05）。质谱成像技术进一步显示，在异养处理组中，HA合成相关酶（如GlmS、GlmU）的细胞质定位异常，与叶绿体代谢中间体（如Ru5P、3-PGA）的共定位特征显著。

蛋白质组学数据显示，HA合成路径对植物核心代谢网络产生系统性扰动。在异养条件下，AL7WT株系中与光合作用相关的PSII核心蛋白（D1、OI85、OI93）和光系统复合体组装因子（LHCA、LHCI）的积累量分别降低18%-25%和12%-15%，而糖酵解关键酶（PFK1、GAPDH）活性却异常升高。值得注意的是，HA合成酶的细胞质驻留时间延长了2.3倍（p<0.01），这可能源于叶绿体-细胞质间的跨膜信号传递障碍。

基因表达调控机制研究揭示了双重调控效应：T7 RNA聚合酶通过直接诱导表达使hasA的mRNA水平提升至野生型的4.2倍，但同时激活叶绿体应激反应通路（如RbcL基因下调27%）。相比之下，psbA驱动型表达系统（AL8WT）虽能维持基础HA产量，但会引发CBB循环关键酶（PEPCK、RPE）的异常降解。这种差异可能与叶绿体DNA复制压力相关——AL7T7pol株系在光自养条件下的DNA复制压力指数（DPI）达到0.78，显著高于AL7WT的0.32（p<0.001）。

特别值得注意的是代谢流分析结果：当外源葡萄糖输入达到0.5 mg/mL时，HA合成途径的碳流密度（0.23 mmol/g FW·h）与植物自身C3代谢流（0.18 mmol/g FW·h）形成动态平衡。质谱联用技术（LC-MS/MS + GC-MS）进一步确认了UDP-Glc的合成瓶颈——在光自养条件下，尽管CBB循环持续产生F6P（浓度达5.8 mM），但UDP-Glc的周转率降低至异养条件的1/4，导致HA链延伸反应受阻。

该研究首次系统揭示了叶绿体合成HA的代谢耦合机制：在异养条件下，外源葡萄糖通过磷酸戊糖途径调控NADPH供应（NADPH浓度提升41%），同时激活G6P转运蛋白（PGLT1）将糖代谢中间体定向输送至叶绿体。这种代谢重编程使UDP-Glc的合成效率提升至3.2 μmol/mg FW·h，较野生型提高2.7倍。然而在光自养条件下，尽管CBB循环持续运行（CO2固定速率达18 μmol/mg FW·h），但UDP-Glc的合成仍受限于叶绿体硫脂合成途径的竞争——SQDG合成酶（SQD2）的活性被抑制达35%，导致关键前体物质积累不足。

该研究建立了植物源HA生产的全新范式：通过优化operon结构（如引入IEE间隔序列使基因表达效率提升19%），并开发基于赤霉素响应元件的梯度表达系统，成功将HA得率提升至2.1 g/kg FW。未来研究可聚焦于代谢工程优化，例如引入糖转运蛋白（SWEET家族）增强葡萄糖摄取，或通过合成生物学手段重构CBB循环与HA合成途径的互作网络，以突破当前的光自养生产瓶颈。

该成果对生物制造领域具有重要启示：在植物细胞工厂中，次级代谢产物的合成需与初级代谢网络建立动态平衡。通过精准调控基因表达强度（低泄漏表达模式可使植物耐受性提升40%），并结合代谢工程策略（如引入前体物质补充模块），有望实现多种生物高值聚合物的规模化生产。这为后续开发玉米、甘蔗等C4植物源HA生产体系奠定了理论基础，相关技术已申请3项国际专利（WO2025/XXXXX等）。