具有反应性氧物种响应性的透明质酸-β-聚乙二醇共聚物纳米颗粒，用于多柔比星递送及口腔鳞状细胞癌的治疗效果

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Reactive oxygen species-responsive hyaluronic acid-b-PEG copolymer nanoparticles for doxorubicin delivery and therapeutic efficacy in oral squamous cell carcinoma

口服鳞状细胞癌纳米药物递送系统研究。通过合成HA-b-PEG共聚物纳米颗粒，负载紫杉醇实现ROS响应性靶向释放。纳米颗粒粒径约138 nm，具备高包封率（≥90%）、pH响应释放特性及显著增强的细胞摄取（AT84细胞系）。体外实验证实氧化应激下药物释放效率提升3倍，流式细胞术显示细胞内药物浓度提高5倍，IC50值降低至传统给药的1/3。该系统通过CD44受体靶向、PEG隐形效应及PBAP连接子ROS敏感性三重机制，有效克服肿瘤耐药性，为OSCC治疗提供新策略。

　　

作者：Inho Bae | Hee Jung Kim | Byung-Hoon Kim

韩国光州全罗大学口腔软组织疾病治疗研究协同中心（MRC），邮编61452

摘要

响应活性氧（ROS）的纳米载体是一种新兴的肿瘤靶向药物递送策略。在本研究中，我们合成了含有ROS敏感连接基团PBAP的透明质酸（HA）-b-聚乙二醇（PEG）共聚物，旨在实现氧化应激条件下多柔比星（DOX）的控释。这种两亲性的HA(PBAP)-b-PEG共聚物自组装成平均直径为138.4 ± 14.8纳米的纳米颗粒，透射电子显微镜观察显示其具有球形形态。DOX通过离子配位和疏水相互作用被包裹进纳米颗粒中，从而实现了高包封效率。体外药物释放研究表明，在生理条件下DOX能够持续释放，而在过氧化氢存在下释放速率显著加快。细胞摄取分析显示，与游离DOX相比，纳米颗粒递送的DOX在AT84口腔鳞状细胞癌中的细胞内积累量增加。细胞毒性实验证实，负载DOX的纳米颗粒具有更强的抗癌活性，尤其是在氧化条件下。总体而言，这些发现突显了HA(PBAP)-b-PEG共聚物纳米颗粒作为ROS触发型口腔癌肿瘤靶向化疗平台的潜力。

引言

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是全球主要的健康问题，占所有口腔恶性肿瘤的90%以上[1]、[2]。尽管手术、放疗和化疗取得了进展，但总体五年生存率仍低于60%[3]、[4]、[5]，这凸显了需要更有效的治疗策略。传统的多柔比星（DOX）化疗方法虽然应用广泛，但其临床效果受到全身毒性、心脏毒性、肿瘤特异性差以及多药耐药性的限制[6]、[7]、[8]。因此，靶向和可控的药物递送策略对于改善OSCC的治疗效果至关重要。基于纳米颗粒的药物递送系统（DDS）作为一种有前景的方法，能够克服传统化疗的局限性：它们改善药代动力学，通过增强渗透性和滞留效应（EPR）提高肿瘤积聚能力，并允许引入靶向配体或响应刺激的基团[9]、[10]、[11]。在各种刺激因素中，活性氧（ROS）特别具有吸引力，因为与正常组织相比，肿瘤组织中的ROS（如过氧化氢、超氧阴离子和羟基自由基）显著增加[12]、[13]、[14]。响应ROS的纳米材料利用这一生化特征实现肿瘤选择性药物释放。多种ROS敏感化学结构（如硫酮、硼酸酯（例如PBAP）和过氧酸盐连接基团）已被整合到聚合物载体中，使其在生理条件下保持稳定，但在氧化环境中降解[15]、[16]、[18]。 透明质酸（HA）是一种天然存在的多糖，能够特异性结合CD44受体，而这种受体在许多癌细胞（包括OSCC细胞）上过度表达[19]、[20]、[21]。另一方面，聚乙二醇（PEG）通过减少调理作用和清除率来提高胶体稳定性并延长系统循环时间[9]、[11]。将HA和PEG结合在单一共聚物中，使纳米颗粒同时具备靶向性和延长循环时间的特点。将ROS敏感连接基团（如PBAP）引入HA-b-PEG结构后，还赋予了其选择性降解和在氧化应激下触发药物释放的功能[17]、[23]。先前的研究已证明，基于HA的ROS响应纳米颗粒在多种肿瘤模型中显著增强了多柔比星的递送、细胞内摄取和抗癌效果[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。基于此基础，本研究重点合成了用于OSCC多柔比星递送的HA(PBAP)-b-PEG共聚物纳米颗粒。我们假设这些纳米颗粒在正常生理条件下保持稳定，在ROS存在下发生降解，并优先在肿瘤细胞内释放DOX。

为了验证这一假设，我们合成了该共聚物，制备了负载DOX的纳米颗粒，并使用AT84口腔鳞状细胞癌对其物理化学性质、ROS响应释放、细胞摄取、细胞毒性和凋亡/坏死诱导进行了系统评估。

材料

透明质酸（HA，分子量约5,000 g/mol）、MePEG（分子量约5,000 g/mol）、PBAP-肼（或具有ROS敏感功能的PBAP类似物）、EDC、HOBt、DMSO、透析膜（分子量 cutoff 1,000 g/mol）、盐酸多柔比星（DOX·HCl）及分析试剂均从商业供应商处购买，使用前均按原样使用。所有水溶液均使用超纯水配制，并通过0.22 μm过滤器过滤。

HA(PBAP)-b-PEG共聚物的合成

将200毫克含有约0.5 mmol羧基的HA溶解在...

聚合物合成与结构表征

HA(PBAP)-b-PEG共聚物是通过EDC/HOBt介导的MePEG与HA偶联反应合成的，随后引入PBAP-肼以实现ROS敏感的疏水段（图1）。反应在水/DMF混合溶剂中进行，氮气保护下，HA:MePEG:PBAP-肼的摩尔比为1:1.2:1.5。经过透析（分子量 cutoff 1,000 Da）和冻干处理后，产率为88%。¹H NMR谱（图2）显示了典型的HA主链峰。

讨论

结果表明，HA(PBAP)-b-PEG是一个有效的平台，它结合了ROS敏感性和靶向功能。¹H NMR验证了PEG和PBAP的接枝效果，证实了化学设计的合理性：25%至30%的PEG提供了亲水性和溶解性，同时保留了足够的疏水性PBAP成分（15%至20%），以确保自组装。这种平衡非常重要，因为太少的疏水成分会阻碍核心的形成，而过多的疏水成分则会降低稳定性。

结论

我们开发了HA(PBAP)-b-PEG纳米颗粒，它结合了CD44靶向的HA、隐蔽性的PEG和ROS敏感的PBAP，从而产生了具有ROS敏感药物释放特性的纳米载体。这些纳米颗粒具有均匀的纳米尺寸（约138纳米）、高DOX载量、ROS触发的释放机制、增强的细胞摄取能力以及在AT84口腔癌细胞中的显著细胞毒性和凋亡效应。这些发现支持了基于HA的ROS响应系统在OSCC靶向化疗中的应用前景。

作者贡献声明

Byung-Hoon Kim：项目监督、资金获取、概念设计。 Inho Bae：写作——审稿与编辑、初稿撰写。 Hee Jung Kim：方法学研究、数据管理

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的使用声明

在准备本研究时，作者使用了ChatGTP进行参考文献审查和校对。使用ChatGTP后，作者根据需要对内容进行了修改，并对发表文章的内容负全责。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的支持，该基金会由韩国政府（MSIT）资助（项目编号RS-2023-00222390）。