哈茨木霉中新型交替病毒ThAV1的分子特征鉴定及其系统发育分析

《Archives of Virology》：Molecular characteristics of a novel alternavirus from Trichoderma harzianum

本研究针对哈茨木霉(Trichoderma harzianum)中新型真菌病毒(Mycovirus)的鉴定与分类问题，开展了分子特征与系统发育分析。研究通过dsRNA提取、NGS测序及RACE验证，成功鉴定出一种新型交替病毒(Alternavirus)，命名为ThAV1。该病毒由4条dsRNA组成，分别编码RdRP、MTase、CP及未知功能蛋白。系统发育分析表明ThAV1属于Alternaviridae科，是首次在木霉属中报道的交替病毒，为真菌病毒多样性及宿主范围研究提供了新见解。

　　

在真菌的微观世界里，除了我们熟知的菌丝和孢子，还潜藏着另一类神秘的“居民”——真菌病毒(Mycovirus)。这些病毒寄生于真菌体内，虽然不直接感染动植物，却在调控真菌的“性格”和“行为”上扮演着重要角色。它们有时能让致病真菌变得“温和”，成为生物防治的得力助手；有时又会让有益真菌“生病”，影响其应用效果。因此，摸清这些病毒的“家底”，了解它们的种类和特性，对于理解真菌的生态功能和应用潜力至关重要。

在众多真菌中，木霉属(Trichoderma)因其在农业和生物技术领域的广泛应用而备受关注。然而，关于木霉体内病毒的研究却相对滞后。此前，科学家们仅在木霉中发现了少数几类病毒，如低毒病毒科(Hypoviridae)、双分病毒科(Partitiviridae)等。而交替病毒科(Alternaviridae)作为一个成员众多的病毒家族，此前从未在木霉属中被发现过。这一空白不仅限制了我们对木霉病毒多样性的认识，也阻碍了我们对这类病毒宿主范围的深入理解。

为了填补这一空白，来自全北国立大学分子生物学与遗传学研究所的研究团队，从一株表现出绿色霉菌症状的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株NFCF419中，成功鉴定并深入解析了一种新型交替病毒。这项研究不仅首次将交替病毒的“领地”扩展到了木霉属，还为我们揭示了这种病毒的完整基因组结构和系统发育地位。相关研究成果已发表于病毒学领域的知名期刊《Archives of Virology》。

关键技术方法

研究人员首先从哈茨木霉菌株NFCF419中提取双链RNA(dsRNA)，通过琼脂糖凝胶电泳观察到多条条带，提示存在多种病毒感染。随后，他们利用二代测序(NGS)技术对dsRNA进行测序，通过生物信息学分析，从混合感染中鉴定出一种新型交替病毒。为了验证NGS结果，研究人员设计了特异性引物进行RT-PCR扩增，并对扩增产物进行测序验证。此外，他们还利用5'-和3'-RACE技术确定了各基因组片段的末端序列，并通过Northern印迹分析确认了各条带与病毒基因组的对应关系。

研究结果

1. 哈茨木霉中新型交替病毒的鉴定与基因组特征

研究人员从哈茨木霉菌株NFCF419中提取dsRNA，经琼脂糖凝胶电泳分析，观察到多条清晰的条带，提示该菌株存在混合病毒感染。通过NGS测序和生物信息学分析，他们从混合感染中鉴定出一种新型交替病毒，并将其命名为“哈茨木霉交替病毒1”(Trichoderma harzianum alternavirus 1, ThAV1)。RT-PCR扩增和测序验证了NGS结果的准确性，Northern印迹分析进一步确认了各条带与病毒基因组的对应关系。

ThAV1的基因组由4条dsRNA组成，其大小分别为3,572 bp (dsRNA1)、2,552 bp (dsRNA2)、2,593 bp (dsRNA3)和1,484 bp (dsRNA4)。序列分析显示，每条片段均含有一个开放阅读框(ORF)，且3'端具有poly(A)尾巴。dsRNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)，dsRNA2编码甲基转移酶(MTase)，dsRNA3编码衣壳蛋白(CP)，而dsRNA4则编码一个功能未知的假设蛋白。值得注意的是，ThAV1的4条基因组片段在5'端非翻译区(UTR)共享一段高度保守的序列(5'-GCCCCGT-3')，这一特征在交替病毒中较为常见。

2. ThAV1编码蛋白的功能预测与序列分析

研究人员对ThAV1各编码蛋白进行了详细的序列分析。dsRNA1编码的RdRP蛋白包含1,124个氨基酸，与已知交替病毒RdRP序列比对显示，其含有RdRP典型的8个保守基序(I-VIII)。特别值得注意的是，在基序VI中，ThAV1的RdRP与大多数交替病毒一样，其金属离子结合三联体序列为ADD，而非典型的GDD，这一特征是其分类的重要依据之一。

dsRNA2编码的MTase蛋白包含768个氨基酸，序列比对发现其含有MTase典型的保守序列GDXPG[T/S][L/F][G/A/S]RXL，但另一个保守序列V[V/T]GXDP[K/R]N仅部分保守。dsRNA3编码的CP蛋白包含764个氨基酸，其编码区长度超过了dsRNA2的MTase编码区，这一现象在部分交替病毒中也有报道。dsRNA4编码的假设蛋白包含350个氨基酸，其序列与已知病毒蛋白相似性较低，功能尚不明确。

3. 系统发育分析揭示ThAV1的分类地位

为了确定ThAV1的分类地位，研究人员构建了基于RdRP氨基酸序列的系统发育树。分析结果显示，ThAV1与来自Dactylonectria torresensis的交替病毒1(DtAV1)亲缘关系最近，两者形成一个独立的分支，并与其他交替病毒共同构成一个大的进化支。系统发育树清晰地表明，ThAV1属于交替病毒科(Alternaviridae)的成员。这一结果从分子水平上证实了ThAV1作为一种新型交替病毒的分类地位。

结论与讨论

本研究成功从哈茨木霉菌株NFCF419中鉴定并解析了一种新型真菌病毒——哈茨木霉交替病毒1(ThAV1)。这是首次在木霉属中报道交替病毒科成员，极大地拓展了该科病毒的宿主范围。

ThAV1的基因组由4条dsRNA组成，分别编码RdRP、MTase、CP和一个功能未知的假设蛋白。序列分析显示，其RdRP具有交替病毒典型的ADD基序特征。系统发育分析进一步证实，ThAV1与已知的交替病毒亲缘关系较近，属于该科的一个新成员。

这项研究的发现具有多重意义。首先，它丰富了木霉属真菌病毒的多样性，为后续研究木霉与病毒之间的相互作用提供了新的材料。其次，ThAV1的发现表明交替病毒在真菌界的分布可能比我们之前认为的更为广泛，这为研究该类病毒的起源和进化提供了新的线索。最后，作为一种新型病毒，ThAV1的生物学功能，特别是其对哈茨木霉菌株NFCF419生长、代谢及生防活性的潜在影响，将是未来研究的重要方向。