《Journal of Inorganic Biochemistry》：When the wrong metal stops the cycle: Dynamics and specificity in plant copper-dependent peptide Cyclases
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本研究首次在无融合伴侣的情况下表达纯化split BURP域肽酶（CamB1和ArbB2），发现铜离子过量抑制催化活性，锌离子显著抑制而银离子抑制较弱，揭示金属应激调控机制。
Courtney M. Petersen | Winston C. Pitts | Shabnam Hematian
化学系，弗吉尼亚理工大学，布莱克斯堡，弗吉尼亚州 24061，美国
摘要
本文报道了将来自Ceanothus americanus的分裂BURP结构域肽环化酶（BpCs），主要是CamB1，使用pET22载体在大肠杆菌中表达，且不添加融合伴侣，同时保留了其无序的N端区域。据我们所知，这是首次在不依赖稳定融合标签（例如麦芽糖结合蛋白MBP）的情况下表达和分离出全长分裂BpC。来自Coffea arabica的CamB1和ArbB2均从包涵体中纯化并重新折叠，并在最小肽底物上表现出强烈的催化活性。铜滴定实验表明，使用谷胱甘肽作为还原剂的催化测定需要远超过活性位点化学计量的铜浓度，当铜浓度超过活性位点化学计量量50倍时，活性趋于稳定，这可能反映了与非特异性铜结合或溶液中的铜形态之间的竞争。使用抗坏血酸代替谷胱甘肽不仅恢复了活性，还提高了最大活性，此时仅需接近化学计量量的铜。金属影响研究显示，非靶金属会强烈抑制活性：在含有Cu(II)、Zn(II)和谷胱甘肽的酶诱导测定中，Zn(II)在低微摩尔浓度下对BpC活性的抑制最为显著；而在还原剂诱导的测定中，这种抑制作用明显减弱，更类似于Ag(I)的适度抑制作用，Ag(I)仅在接近1 mM的浓度下才完全抑制活性。这些结果强调了测定顺序对活性位点上金属竞争的影响。鉴于BURP结构域蛋白参与植物的应激反应，包括对金属暴露的耐受性，这些发现表明Zn(II)和Ag(I)的抑制作用可能是环境金属胁迫调节BpC活性的生化机制。
部分摘录
CRediT作者贡献声明
Courtney M. Petersen：撰写初稿、验证、方法学设计、实验研究。
Winston C. Pitts：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析。审稿与编辑、项目监督、资金筹集、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢弗吉尼亚理工大学提供的启动资金支持。本研究得益于UNCG三重质谱设施和弗吉尼亚理工大学Fralin生命科学研究所质谱孵化器的设施与专业支持。我们感谢Warren Vidar博士在质谱数据收集方面的帮助，以及Keith Ray博士在蛋白质组学方面的专业知识以及通过凝胶内消化和LC-MS/MS技术进行肽质量指纹分析（PMF）方面的支持。
