LOV光敏结构域蛋白动力学从皮秒到昼夜尺度的演化与设计研究

《Journal of Molecular Biology》：Evolution and design shape protein dynamics in LOV domains – spanning picoseconds to days

本研究针对LOV光敏结构域在亿万年演化过程中功能多样性形成的动力学约束机制尚不明确的问题，系统表征了21个天然LOV核心结构域的动力学特性，发现其光循环动力学存在从皮秒到昼夜尺度的显著多样性，并鉴定出与演化分支对应的功能簇。研究人员还通过人工智能设计出具有独特生物物理特性的人工LOV变体。该研究揭示了演化如何塑造蛋白质动力学，为拓展光遗传学工具库提供了新见解，对理解蛋白质演化规律和设计新型光控工具具有重要意义。

　　

在生命演化的长河中，光敏蛋白作为生物感知环境的重要工具，已经存在了数十亿年。其中，光-氧-电压（LOV）结构域作为一类广泛存在的蓝光感受器，控制着从光趋向性、昼夜节律到基因调控等多种生理过程，并日益成为光遗传学领域的重要工具。然而，一个长期悬而未解的科学问题是：亿万年演化过程究竟如何塑造了LOV蛋白的动力学特性，从而形成了其丰富的功能多样性？

传统研究多聚焦于单个LOV同源蛋白的深入分析，缺乏对整个人类已知LOV家族功能多样性的系统性比较。尽管过去二十年的研究已经发现LOV光循环动力学可以通过活性位点半胱氨酸周围的单氨基酸替换、FMN口袋中的疏水残基以及保守谷氨酰胺的氢键模式变化而显著改变，但这些研究大多局限于少数几个模式系统。演化过程在整个LOV家族中设定了怎样的功能边界，自然界的LOV多样性究竟有多大，这些问题仍然没有得到系统解答。

为了解决这一知识空白，苏黎世大学的研究团队在《Journal of Molecular Biology》上发表了一项开创性研究，通过对21个天然LOV核心结构域的系统表征，将光谱解析的LOV目录扩展了18个此前未研究的变体，涵盖了从植物到细菌的广泛物种来源。研究团队运用时间分辨光谱技术，揭示了LOV家族中从皮秒到天数尺度的非凡动力学多样性，并鉴定出与演化分支相对应的独特功能簇。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过生物信息学分析构建LOV系统发育树并选择代表性变体；利用蛋白质重组表达技术获得21个LOV核心结构域；应用时间分辨红外光谱解析早期光循环中间体；通过稳态紫外/可见光谱测定暗态恢复速率；结合全局多指数拟合和寿命分析提取精确时间常数；采用支持向量机进行功能分类分析；并利用人工智能辅助的蛋白质逆向折叠算法设计人工LOV变体。

光谱分析来自生命之树各分支的21个LOV光敏结构域

研究团队实验研究了来自真核和原核物种的21个LOV同源蛋白，这些蛋白在系统发育树中分布均匀。通过时间分辨红外光谱，研究人员解析了LOV光循环的三个关键过程：单线态到三线态的系间窜越（ISC，纳秒尺度）、三线态衰变和同时发生的硫加合物形成（微秒尺度）以及暗态恢复（共价键断裂）。研究获得了精确的时间常数，其中单线态寿命（τ₁）范围为0.5-3.5纳秒，硫加合物形成时间（τ₂）范围为1.2-18.8微秒。通过演化相关差谱分析，研究人员估算了系间窜越量子产率（Φ_ISC）和硫加合物形成效率（Ψ_eff），发现不同LOV变体间存在显著差异。

自然界提供了广泛的多样化LOV光敏结构域目录

拥有21个LOV结构域的完整光循环动力学数据后，研究人员通过比较光谱衍生的动态参数对LOV结构域进行分类。在生物物理景观图上，研究人员观察到三个明显的簇：一个由具有中等到慢速恢复的原核LOV核心结构域主导的广泛簇，以及两个由通常具有更快动力学的植物光敏蛋白LOV1和LOV2型结构域组成的更紧凑簇。特别值得注意的是，植物光敏蛋白在研究中的形成了明显不同的簇：LOV2簇表现出非常快的恢复和中等到高的光循环效率，而LOV1簇显示出非常低的效率和中等至快速的暗态恢复。

研究发现，LOV1和LOV2结构域之间的功能分化可能发生在大约15亿年前，并在约10亿年的时间尺度上展开。LOV2簇的多样化（包括超快恢复）与大约4亿年的演化跨度相容。这些生物物理调谐可能使这些谱系能够对光响应进行更精细的时间控制，与光趋向生物的生态需求保持一致。

具有独特特性的计算设计的LOV

基于LOV功能簇的分类，研究人员设计了一种新的人工LOV光敏蛋白，并研究了其在由关键生物物理参数定义的功能景观中的位置。研究团队选择拟南芥LOV2变体作为结构模板，采用蛋白质逆向折叠模型LigandMPNN进行序列重新设计。得到的人工蛋白与模板仅有51%的序列同一性，但保持了高度的结构相似性。

该人工LOV变体表现出极高的产量和稳健性，其热稳定性远远超过拟南芥LOV2，在超过90°C的温度下仍能保持稳定折叠。紫外/可见光谱显示其存在明显的暗/光状态和显著减慢的背反应速率，降低了三个数量级。时间分辨光谱显示，人工LOV与其模板变体相似，表现出纳秒和微秒动力学，时间常数和光谱特征与其他LOV2结构域相似。

结论

古老的LOV蛋白家族普遍存在于生命的所有主要领域，使生物体能够感知和响应光，调节昼夜节律，并协调细胞过程。这项研究通过先进的光谱技术阐明了自然界及以外的LOV核心结构域的功能多样性。研究结果揭示了LOV成员中从数百皮秒（10^-10秒）到天数（10⁶秒）的非凡动力学过程范围。

通过绘制LOV结构域的生物学物理景观，研究人员确定了独特的功能生态位。引人注目的是，研究的真核和原核变体之间以及来自植物的高度特化的LOV核心结构域（LOV1和LOV2）之间观察到了明显的分界。将它们的超快蛋白质动力学与十亿年演化时间尺度联系起来，研究人员发现功能分化反映了LOV2分支内约4亿年以及LOV1和LOV2簇之间约10亿年的演化分离。

借助人工智能驱动的逆向折叠算法，研究人员通过蛋白质设计设计了一种新型LOV光敏蛋白。尽管与所有研究的天然LOV光敏蛋白在序列上相距甚远，但人工LOV结构域表现出一系列独特的生物物理特性，并作为未来在光遗传学背景下创建新型LOV光敏蛋白结构域的方法的蓝图。

这项工作强调了理解演化过程如何关键地塑造蛋白质动力学的重要性，从而创造了蛋白质功能的新生态位。通过将生物物理学与演化生物学相结合，研究人员提供了一个基于其十亿年过去并指向其在人为应用中未来的分子多样性的整体视角，架起了演化与设计之间的桥梁。