中央杏仁核PKCδ神经元介导芬太尼戒断反应：揭示阿片依赖的新细胞机制

《Neuropsychopharmacology》：Central amygdalar PKCδ neurons mediate fentanyl withdrawal

本刊推荐：为破解阿片戒断厌恶这一阻碍长期戒断的关键难题，研究人员聚焦中央杏仁核（CeA）内分子特异性神经元群。研究揭示，表达蛋白激酶C-δ（PKCδ）的CeA外侧囊部（CeLCPKCδ）神经元在芬太尼依赖小鼠戒断期间呈现显著高活性与高敏感性。通过光纤光度记录、Kir2.1慢性抑制及狂犬病毒环路追踪等技术，证实抑制CeLCPKCδ神经元可显著缓解戒断症状，并鉴定出μ-阿片受体（MOR）表达的直接输入通路。该发现为理解阿片依赖的细胞机制提供了新视角。

　　

阿片使用障碍（Opioid Use Disorder, OUD）及其相关的过量死亡，是当前美国过量危机的主要推手。长期阿片暴露会导致身体依赖，一旦停止使用μ-阿片受体（Mu-Opioid Receptor, MOR）激动剂或使用其拮抗剂，便会引发极度厌恶的戒断综合征。这种严重的戒断体验是患者维持阿片戒断最常见的主观障碍之一。因此，深入理解身体依赖和戒断状态如何调动大脑中编码厌恶状态的神经环路，对于开发使戒断更可耐受、降低复吸和意外过量风险的策略至关重要。

中央杏仁核（Central Amygdala, CeA）作为大脑厌恶处理通路中的关键节点，负责协调对潜在威胁或有害刺激的快速回避、逃避、情感和自主神经反应。既往研究表明，拮抗剂催发的阿片戒断能增加CeA中的神经活动标志物，如即刻早期基因FOS和钙离子（Ca²⁺）活性。然而，CeA并非作为一个单一整体运作，而是由多个在功能、转录组和解剖上截然不同的细胞类型组成，这些细胞对刺激的反应各异，且常常对行为产生相反的影响。尽管近年研究日益揭示CeA神经元的多样性，但这些不同的细胞类型如何在阿片戒断期间独特地贡献于CeA的高度活动，仍未得到充分探索。

表达蛋白激酶C-δ（Protein Kinase C-delta, PKCδ）的神经元位于CeA的外侧分部（CeA lateral capsule, CeLC），是处理厌恶刺激（尤其与疼痛和威胁检测相关）的关键调节器。近期研究表明，CeLC^PKCδ神经元在物质使用障碍的背景下也发挥作用，例如在慢性酒精使用和甲基苯丙胺戒断期间介导与药物使用相关的决策。值得注意的是，一部分CeLC^PKCδ神经元表达MOR，这是芬太尼、吗啡等外源性阿片类药物的主要分子靶点。这使CeLC^PKCδ神经元成为研究阿片依赖和戒断神经环路的极具吸引力且重要的靶点。

本研究旨在填补这一空白，通过研究CeLC^PKCδ神经元是否贡献于阿片戒断的神经和行为效应。研究人员利用细胞类型特异性钙成像、活动调控和全脑环路图谱技术，深入探究了CeLC^PKCδ神经元在芬太尼戒断中的活动动态、全脑连接性和功能贡献。

主要关键技术方法

本研究综合运用了多种关键技术：1) 利用Prkcd-Cre或Oprm1-Cre转基因小鼠进行细胞类型特异性操作；2) 通过免疫组织化学检测活动依赖性基因FOS的表达，定位戒断活跃神经元；3) 采用光纤光度术（Fiber Photometry）在体记录CeLC^PKCδ神经元在戒断期间及应对伤害性刺激时的钙离子活动动态；4) 通过病毒介导的钾通道Kir2.1过表达，在芬太尼暴露期间慢性抑制CeLC^PKCδ神经元活动，评估其对戒断症状的影响；5) 结合狂犬病毒介导的单突触环路追踪和颜色切换示踪病毒，在全脑范围绘制向CeLC^PKCδ神经元提供直接输入且表达MOR的突触前神经元分布。实验所用小鼠由宾夕法尼亚大学内部繁殖和维持。

研究结果

precipitated fentanyl withdrawal increases cellular activity in CeLC^PKCδneurons

为验证芬太尼戒断是否增加CeLC^PKCδ神经元活性，研究人员使Prkcd-Cre小鼠通过饮用芬太尼水（0.02 mg/mL）8天形成身体依赖。在第八天，给予纳曲酮（1 mg/kg）可引发典型的戒断体征。戒断小鼠CeA内FOS+细胞核密度显著高于其他对照组。

p<0.01;p<0.001;p<0.0001.f Fentanyl-drinking/naltrexone mice(i.e., withdrawal mice) had significantly higher densities of FOS+ nuclei in the CeC(left) and the CeL(middle) subnuclei of the CeA than mice in other experimental conditions, but only a higher density than water-drinking/saline mice in the CeM subnucleus(right). Water-drinking/naltrexone mice also had significantly higher densities of FOS+ nuclei in the CeC and CeL compared to water-drinking/saline mice. CeC: Two-way ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of drinking condition(F(1,12)=28.68,p=0.0002) and naltrexone condition(F(1,12)=53.61, p<0.0001). CeL: Two-way ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of drinking condition(F(1,12)=34.65, p<0.0001), naltrexone condition(F(1,12)=63.01, p<0.0001), and naltrexone x drinking interaction(F(1,12)=5.262, p=0.0406). CeM: Two-way ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of drinking condition(F(1,12)=11.78,p=0.005).p<0.05;p<0.01;p<0.001;p<0.0001.g Fentanyl withdrawal is associated with significantly more FOS+ nuclei in the CeA than any control conditions at AP-1.0 mm and AP-1.2 mm from bregma. Yellow shading: approximate region targeted by viral vector injections in Figs.2-5. Three-way ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of coordinate(F(7,96)=7.103,p<0.0001), drinking condition(F(1,96)=63.54,p<0.0001), naltrexone condition(F(1,96)=153.1,p<0.0001), coordinate x drinking interaction(F(7,96)=3.382,p=0.0029),and coordinate x naltrexone interaction(F(7,96)=2.882, p=0.0089). Asterisks: fentanyl-drinking/naltrexone vs water-drinking/saline(black)vs. water-drinking/naltrexone(gray); vs. fentanyl-drinking/water(pink); hash marks: water-drinking/naltrexone vs. water-drinking/saline(gray)Points and area fill represent mean values±SEM.p<0.05;p<0.01;p<0.001;*p<0.0001.h FOS immunoreactivity colocalizes with PKC8 immunoreactivity in the CeLC.Arrowheads: PKCδ+/FOS+ cells.Scale bars: large image 250μm,inset 100μm.i Significantly more PKCδneurons co-express FOS during withdrawal than during any other condition. Two-way ANOVA, significant effect of drinking condition(F(1,28)=19.82,p=0.0001) and naltrexone(F(1,28)=66.46,p<0.0001).j Significantly more FOS+ neurons co-express PKC following a naltrexone injection in naive mice compared to water-drinking/saline mice. Water-drinking/saline: n=4m,4f; water-drinking/naltrexone:n=4m,4f; fentanyl-drinking/saline:n=3m,5f;Fentanyl-drinking/naltrexone:n=4m,4f.Two-way ANOVA, significant effect of injection(F(1,28)=5.384,p=0.0278).p=0.0374.'>

戒断相关的FOS+细胞核主要集中于CeA的外侧分部（CeLC），尤其是在前部（前囟后-1.0 mm至-1.2 mm）。共染色显示，戒断显著增加了与FOS共表达的PKCδ神经元比例，表明CeLC^PKCδ神经元在戒断期间被特异性激活。

CeLC^PKCδneurons are tuned to salient aversive and noxious stimuli

研究人员通过光纤光度法记录了阿片初始状态小鼠CeLC^PKCδ神经元对多种体感刺激的反应。无害轻触引起Ca²⁺信号小幅下降，而所有厌恶刺激（针刺、热水滴、气流喷射）均引起Ca²⁺信号增加。

p=0.0329.d Noxious pinprick did not significantly affect AUC(Paired t-test),but female mice showed significantly higher post-stimulus AUCs than male mice. Two-way ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of sex(F(1,11)=6.189,p=0.0302).p=0.0232.e Noxious hot water was associated with a significant increase in AUC(Paired t-test,t=2.590,p=0.0237), driven by a significant increase between timepoints primarily in female mice(p=0.0046) and significantly greater post-stimulus AUCs in female compared to male mice(p=0.0005). Two-way Repeated Measures ANOVA with Bonferroni's correction,significant effect of timepoint(F(1,11)=5.570,p=0.037) and sex(F(1,11)=13.14,p=0.0040). f Aversive airpuff was associated with a significant increase in AUC(Paired t-test,t=4.733,p=0.0005), which was driven by significant increases in female mice and a trend towards significant increases in male mice.Two-way Repeated Measures ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of timepoint(F(1,11)=19.09,p=0.0011).p=0.0025. Lines and area fill represent mean values of 10 trials/subject, averaged across all subjects,±SEM(n=8 females and 5 males). g Pinprick, noxious hot water, and aversive non-noxious airpuff produced a significantly higher peak than innocuous light touch(One-way repeated measures ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of stimulus(F(1.333, 15.99)=58.07,p<0.0001) and significant effect of subject(F(12,36)=15.80,p<0.0001).p=0.0263;p=0.002;p=0.0034.h Compared to innocuous light touch,noxious hot water, and aversive airpuff produced a significant increase in the AUC. Repeated measures one-way ANOVA with Bonferroni's correction, significant effect of treatment(F(2.50, 30.96)=11.35,p<0.0001).p=0.0114,**p=0.0009.'>

结果表明，在阿片初始状态的雌性小鼠中，CeLC^PKCδ神经元主要对厌恶刺激产生反应，且不区分伤害性厌恶与非伤害性厌恶刺激。神经元活动更接近于编码刺激内容而非具体行为反应。

Opioid administration and precipitated withdrawal dynamically modulate CeLC^PKCδneuron activity

在芬太尼依赖小鼠中，纳洛酮催发的戒断使CeLC^PKCδ神经元自发性活动急剧且持续升高。与基线状态和急性芬太尼给药后相比，戒断期间神经元对伤害性热水滴刺激的反应峰值和曲线下面积（AUC）均显著增强。

相比之下，急性芬太尼注射降低了神经元对气流喷射的反应峰值，但在戒断期间此反应未发生显著变化。这些结果说明，芬太尼戒断使CeLC^PKCδ神经元处于高活性状态，并对伤害性刺激表现出超敏化。

CeLC^PKCδneuron inhibition does not alter pain sensitivity but prevents fentanyl withdrawal symptoms

为检验CeLC^PKCδ神经元活动是否为芬太尼依赖所必需，研究人员通过病毒介导在CeLC^PKCδ神经元中过表达钾通道Kir2.1，实现慢性抑制。结果显示，Kir2.1抑制并不影响阿片初始状态小鼠的机械痛和热痛阈值，也不影响其对伤害性热水的厌恶动机反应。

然而，在自发戒断测试中，尽管Kir2.1表达组和EGFP对照组小鼠消耗了相似剂量的芬太尼，但Kir2.1表达显著减轻了芬太尼戒断症状。Kir2.1表达的芬太尼饮用小鼠其整体戒断评分、震颤/颤抖和自主神经戒断体征均显著低于EGFP表达的芬太尼依赖小鼠，且与饮水对照组无显著差异。

这些发现表明，慢性抑制CeLC^PKCδ神经元活动能够预防芬太尼戒断症状的出现，而不影响基础的伤害性感受。

Brain-wide identification of opioid-sensitive inputs to CeLC^PKCδneurons

为探究CeLC^PKCδ神经元的高活性是否由阿片敏感的输入驱动，研究人员联合运用狂犬病毒单突触环路追踪和颜色切换示踪技术。他们首先在全脑范围绘制了向CeLC^PKCδ神经元提供直接输入的脑区，发现密集的输入来自纹状体、杏仁核、延伸杏仁核以及感觉皮层（如体感、听觉皮层）等区域，丘脑、下丘脑、苍白球和臂旁核（Parabrachial Nucleus, PBN）也是重要的输入源。

随后，利用在Oprm1-Cre小鼠中表达的 retrograde 颜色切换病毒，他们评估了上述输入脑区中表达MOR的CeA投射神经元的比例。结果显示，所有被检测的脑区均包含Oprm1+和Oprm1-的输入，其中其他杏仁核区域和感觉皮层区域含有较高比例的Oprm1+输入。这提示多个向CeLC^PKCδ神经元提供直接输入的脑区其投射神经元可能直接受到阿片药物的调节。

结论与意义

本研究系统阐明了中央杏仁核中表达PKCδ的特定神经元群体在阿片戒断中的核心作用。研究发现，芬太尼戒断会引发CeLC^PKCδ神经元的快速、持续高活性和对伤害性刺激的超敏反应。通过慢性抑制这些神经元，可以显著缓解戒断的躯体症状。此外，研究还鉴定出多个可能直接受阿片调节、向CeLC^PKCδ神经元提供输入的全脑环路。

这些发现具有多重重要意义。首先，它们揭示了阿片依赖中一个关键的细胞机制，即CeLC^PKCδ神经元的高活性是戒断躯体体征的基础。其次，研究结果将参与疼痛处理的神经网络（CeLC^PKCδ神经元）与阿片戒断联系起来，为理解慢性疼痛与OUD的高共病性提供了潜在的共享生物学机制。最后，鉴定出表达MOR的特定输入通路为未来开发针对特定环路的、不影响疼痛管理的OUD治疗策略提供了新的靶点。

总之，这项发表在《Neuropsychopharmacology》上的工作强调了在CeA内进行细胞类型特异性研究的重要性，对于开发针对OUD的精准治疗策略至关重要。