N端结构域对sHSP Lo18功能的影响：揭示其在寡聚化、分子伴侣及脂质伴侣活性中的关键作用

《Scientific Reports》：Impact of N-terminal domain on the sHSP Lo18 function

本研究针对细菌小热休克蛋白（sHSP）Lo18的N端结构域功能未知的问题，通过构建N端缺失27个氨基酸的截短蛋白（Lo18△27），系统评估了该结构域对蛋白寡聚结构、分子伴侣活性及脂质伴侣功能的影响。结果表明，N端结构域对维持Lo18寡聚体稳定性、防止蛋白质热聚集及调控膜流动性至关重要，为理解sHSPs的结构-功能关系提供了新见解。

　　

当细胞遭遇外界压力，比如突然的高温，其内部环境会陷入混乱——蛋白质会错误折叠，细胞膜的秩序也会被打乱。为了应对这种危机，细胞进化出了一套精妙的防御机制，其中之一就是迅速生产一类名为热休克蛋白（Heat Shock Proteins, HSPs）的“急救员”。在这个蛋白质家族中，有一群个头较小的成员，被称为小热休克蛋白（small Heat Shock Proteins, sHSPs），它们虽然分子量小（通常小于35 kDa），但能力非凡，能够在没有能量（ATP）供应的紧急情况下，充当“分子伴侣”（chaperone），防止其他蛋白质因应激而聚集沉淀；其中一些成员甚至还能扮演“脂质伴侣”（lipochaperone）的角色，帮助稳定细胞膜的结构。

所有这些sHSPs都共享一个典型的“三段式”结构：一个高度保守的中央α-晶状体结构域（Alpha-Crystallin Domain, ACD），以及两端变化较多的N端结构域和C端结构域。这种结构使得它们能够像搭积木一样，组装成从二聚体到由数十个亚基组成的大型寡聚体。通常认为，大型寡聚体主要负责分子伴侣功能，而二聚体形式则与脂质伴侣活性相关。多年来，科学家们对ACD的结构和功能已经有了比较深入的了解，它被公认为sHSPs寡聚化和功能发挥的核心。然而，对于两端的结构域，尤其是序列多变、看似“无序”的N端结构域，其在原核生物（如细菌）来源的sHSPs中的具体功能，仍然是一个巨大的谜团。揭示这个谜团，对于全面理解sHSPs的工作机制至关重要。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员将目光投向了来源于乳酸菌Oenococcus oeni的sHSP Lo18。Lo18是研究细菌sHSPs的一个经典模型。为了精确评估其N端结构域的功能，研究团队巧妙地构建了一个截短突变体蛋白Lo18△27——它缺失了野生型Lo18蛋白最前端的27个氨基酸。通过系统比较野生型Lo18和Lo18△27在寡聚结构、防止蛋白质聚集（分子伴侣活性）以及维持膜流动性（脂质伴侣活性）等方面的表现，并深入探究其与膜相互作用的机制，该研究清晰地揭示了Lo18的N端结构域在其功能中扮演的“多面手”角色。

为开展本研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，通过分子克隆技术构建了表达N端截短蛋白（Lo18△27）的工程菌株。其次，利用甲醛交联结合免疫印迹（Western blot）和动态光散射（DLS）技术，分别分析了蛋白质小寡聚体和大寡聚体的结构状态。第三，通过热诱导蛋白质聚集实验评估了分子的伴侣活性。第四，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析胰蛋白酶消化后的肽段，鉴定了Lo18与膜相互作用的潜在位点。最后，利用DPH荧光探针和各向异性测量技术，精确监测了蛋白质对膜流动性的影响（脂质伴侣活性）。研究所用的脂质体来源于O. oeni培养物提取的脂质。

2. 结果

2.1 删除N端结构域导致Lo18寡聚体结构稳定性丧失

研究人员首先关注N端结构域对Lo18蛋白自身结构的影响。通过甲醛交联和免疫印迹分析，他们发现，与形成清晰、稳定寡聚体条带的野生型Lo18相比，截短蛋白Lo18△27的电泳图谱出现了更多条带，背景模糊，表明其寡聚体结构非常不稳定，更容易解离成单体、二聚体等小分子形式。动态光散射（DLS）的结果进一步证实了这一点：野生型Lo18的寡聚体尺寸分布相对均匀，而Lo18△27则倾向于形成异常巨大的寡聚体（超过90个亚基），这可能是由于亚基间正常相互作用被破坏后形成的无规则聚集。这些结果共同表明，N端结构域对于Lo18形成和维持正常、稳定的寡聚体结构至关重要。

2.2 N端结构域在Lo18功能中的关键作用

2.2.1 对分子伴侣活性的贡献

接下来，研究测试了N端结构域在分子伴侣功能中的作用。实验将O. oeni的细胞裂解液加热至55°C，模拟热应激条件。结果显示，加入野生型Lo18能有效防止裂解液中的蛋白质发生热聚集，而未加蛋白的对照组或加入Lo18△27的实验组，蛋白质聚集量显著增加了约25%。这表明，缺失N端结构域后，Lo18防止蛋白质错误折叠和聚集的“监护”能力大大降低，其分子伴侣活性受到了严重损害。

2.2.2 参与膜相互作用和稳定性

2.2.2.1 与膜相互作用的潜在位点

为了探究Lo18是如何与膜相互作用的，研究人员采用了蛋白酶水解结合色谱分析的方法。他们将Lo18蛋白与胰蛋白酶一起孵育，比较在有或无O. oeni来源脂质体存在下的肽段消化图谱。结果发现，有三个肽段在脂质体存在时消失了，说明它们可能与膜结合并在后续步骤中被离心除去。这三个肽段分别位于ACD的β3-β4片层之间、β4-β5片层之间，以及一个覆盖了N9到R30位氨基酸的大片段（这几乎就是被删除的N端结构域的主要部分）。这直接证明，Lo18的N端结构域直接参与了和细胞膜的相互作用。

2.2.2.2 N端结构域对脂质伴侣活性的贡献

既然N端结构域参与膜相互作用，那么它是否影响脂质伴侣活性呢？研究人员通过荧光各向异性实验进行了验证。他们制备了O. oeni脂质体，并用DPH荧光探针监测其膜流动性（各向异性值与流动性成反比）。实验发现，在室温下，加入野生型Lo18能使膜流动性显著降低（即各向异性值升高），说明蛋白插入使膜变得更加刚性；而Lo18△27的这种效应则弱得多。当施加45°C热应激后，脂质体膜迅速变得流动。此时，野生型Lo18能有效抑制这种流动化，而Lo18△27的保护作用则大打折扣。这表明，N端结构域的缺失不仅削弱了Lo18与膜的结合能力，也显著损害了其作为脂质伴侣、维持膜稳定的功能。

3. 讨论与结论

本研究系统地阐明了N端结构域对细菌sHSP Lo18的多重关键作用。首先，该结构域是维持正常、稳定寡聚体结构所必需的，其缺失会导致蛋白寡聚状态紊乱，出现过多小寡聚体和异常大聚集体。其次，N端结构域对Lo18的分子伴侣和脂质伴侣活性都不可或缺。在分子伴侣功能方面，它可能既通过稳定功能性寡聚体，也通过其疏水区直接与变性蛋白质底物结合来发挥作用。在脂质伴侣功能方面，研究直接证实了N端结构域（特别是N9-R30区域）是膜相互作用的关键位点之一，其疏水特性有助于蛋白锚定在膜上，从而有效调控膜流动性以应对热应激。

综上所述，这项研究令人信服地表明，尽管sHSPs的N端结构域序列保守性低，但在细菌sHSP Lo18中，它是一个核心的功能性模块。它不仅仅是连接ACD的一个“纽带”，而是在协调蛋白寡聚化、介导与不同底物（错误折叠的蛋白质和脂质膜）相互作用中发挥着决定性作用，是Lo18行使分子伴侣和脂质伴侣双重功能的分子基础。该发现深化了我们对sHSPs结构与功能关系的理解，特别是为原核生物sHSPs的功能研究提供了重要见解。