枯草芽孢杆菌产多酶及其海藻酸盐微胶囊化技术：提升饲料添加剂稳定性的新策略

《Scientific Reports》：Multi enzyme production and alginate encapsulation from Bacillus subtilis for stable feed additives

本研究针对饲料用酶成本高、稳定性差的问题，通过响应面法优化枯草芽孢杆菌同时产蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的工艺，并利用海藻酸盐微胶囊化技术显著提高了酶的热稳定性、pH耐受性和贮藏稳定性，为开发高效稳定的复合酶饲料添加剂提供了新方案。

　　

在畜禽养殖业中，饲料成本占总生产成本的60%-70%，提高饲料利用率一直是行业关注的焦点。外源酶制剂作为饲料添加剂，能有效降解饲料中的抗营养因子，提高营养物质的消化吸收率。然而，商业酶制剂面临两大挑战：生产成本高昂，以及在贮藏和高温制粒过程中稳定性差。更为棘手的是，家禽饲料需要多种水解酶（如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶）的协同作用才能达到最佳效果，而以往的研究多集中于单一酶的优化或固定化。

针对这一技术瓶颈，巴基斯坦费萨拉巴德农业大学生物化学系的Hamza Rafeeq、Muhammad Anjum Zia等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。他们创新性地从一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中同时优化生产四种水解酶，并采用海藻酸盐微胶囊化技术显著提升了酶的稳定性，为开发高效、稳定的复合酶饲料添加剂提供了新策略。

关键技术方法

研究团队首先采用响应面法（RSM）系统优化了枯草芽孢杆菌产蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的发酵条件（pH、温度、孵育时间和接种量）。随后通过硫酸铵沉淀、透析和凝胶过滤层析（Sepharose CL-6B）对粗酶进行纯化，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定酶分子量。最后，通过挤出法将纯化酶封装于海藻酸盐微球中，并利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线衍射（XRD）对微胶囊化酶进行表征，系统评估了封装前后酶的温度、pH适应性及贮藏稳定性。

4.2.1.1 蛋白酶响应面二次模型的方差分析

通过响应面优化，研究发现四种酶的最适产酶条件均为pH 7。蛋白酶的最适温度为25°C，而脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的最适温度为40°C。蛋白酶和纤维素酶在72小时达到最高活性，而脂肪酶和淀粉酶在48小时活性最高。在接种量方面，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶在3 mL时活性最高，纤维素酶则在2 mL时最佳。方差分析（ANOVA）结果表明，蛋白酶和淀粉酶的模型预测精度较高，而脂肪酶和纤维素酶的模型预测能力相对有限。

酶纯化

酶纯化结果显示，经过凝胶过滤层析后，蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶分别纯化了87.5、42.6、68.12和89.03倍，比活性分别达到26.4、82.73、85.3和56.2 IU/mg。SDS-PAGE分析确定这四种酶的分子量分别为29 kDa、45 kDa、45 kDa和56 kDa。

海藻酸盐包被酶的表征

傅里叶变换红外光谱分析显示，海藻酸盐包被的酶在1000 cm^-1附近出现海藻酸盐多糖结构的特征峰（C-O和C-O-C振动），在1600 cm^-1附近出现海藻酸盐羧酸盐基团中C=O伸缩振动及酶中酰胺N-H弯曲振动的特征峰，证实了酶的成功包被。

X射线衍射分析显示，海藻酸盐包被的酶呈现明显的尖锐衍射峰，表明其具有明确的晶体结构，这有助于提高酶的稳定性。

酶动力学

温度影响

未包被的蛋白酶在50-60°C、脂肪酶在40°C、纤维素酶在40-60°C、淀粉酶在50°C活性最高。微胶囊化后，四种酶的活性温度范围均显著拓宽，蛋白酶在40-70°C、脂肪酶在35-65°C、纤维素酶在35-70°C、淀粉酶在40-70°C均能保持较高活性。

pH影响

未包被的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的最适pH分别为7.5、7、5和6。微胶囊化后，酶的活性pH范围明显扩大，分别在pH 5-10、5.5-9.5、4-9和4.5-9.5范围内保持较高活性。

稳定性

在4°C下贮藏30天的稳定性测试中，微胶囊化酶的残留活性显著高于游离酶。蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的微胶囊化形式分别保留了74%、67%、61%和66%的初始活性，而游离酶仅保留35%、42%、34%和39%的活性。

讨论与结论

本研究成功优化了枯草芽孢杆菌同时产四种水解酶的工艺，并证明海藻酸盐微胶囊化能有效提高酶的稳定性。与壳聚糖、纳米复合材料等高级载体相比，海藻酸盐具有成本低、食品级、应用简单的优势，更适合饲料工业应用。酶的热稳定性和pH耐受性增强表明其在饲料制粒和贮藏过程中可能具有更好的韧性，这有助于减少酶在摄入前的降解，提高饲料养分消化率。

该研究的创新点在于从单一菌株中同时优化四种水解酶的生产，并采用统一的微胶囊化策略，为开发协同作用更强的复合酶饲料预混料提供了平台。虽然研究显示了良好的体外潜力，但作者也指出缺乏体内试验是当前的主要限制，未来工作将集中于将这些酶整合到家禽饲料配方中，并通过肉鸡试验评估其生长性能、饲料转化率和养分消化率。

这项研究为开发低成本、高稳定性的复合酶饲料添加剂奠定了坚实基础，有望为饲料工业提供更加经济有效的酶制剂解决方案。