睾丸与射精精子DNA碎片化及端粒长度的比较研究：揭示精子质量的新维度

《Scientific Reports》：A comparison of sperm parameters DNA fragmentation and telomere length in testicular versus ejaculated spermatozoa

本研究针对睾丸与射精精子质量争议，系统比较了精子参数、DNA碎片化(DFI)和端粒长度(STL)。发现睾丸精子DNA损伤显著升高，且伴有更高形态异常率和反应顶体，非梗阻性无精子症(M-TESE)组端粒最短。结果挑战了"睾丸精子DNA更完整"的传统认知，为男性不育诊疗提供新依据。

　　

在男性不育的临床诊疗中，一个长期存在的争议焦点在于：当面临精子DNA损伤过高的情况时，是否应该绕过自然排精过程，直接通过手术从睾丸中获取精子用于胞浆内单精子注射(ICSI)？传统观点认为，精子在附睾运输过程中会遭受氧化应激等损伤，因此，直接从“源头”——睾丸获取的精子，其DNA应该更为完整。这一假设促使睾丸精子提取(TESE)技术被应用于非无精子症的患者，如严重少弱畸精子症(OAT)或高DNA碎片化指数(DFI)的病例。然而，支持这一做法的临床证据并不充分，且已有研究在方法学上存在局限，例如DNA损伤评估技术不统一或评估时间延迟。更关键的是，有证据表明，相当一部分DNA损伤其实源于睾丸内的生精过程本身。此外，精子端粒长度(STL)作为一种新兴的生物标志物，其与精子DNA损伤和男性不育的关系也日益受到关注，但此前从未在睾丸精子中进行过研究。

为了更全面、准确地揭示睾丸精子的真实面貌，由Malihe Afsari、Azam Agha-rahimi等研究人员组成的团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究。他们设计了一项横断面研究，招募了60名男性，并将其分为四组进行对比：精液参数正常的对照组、患有严重少弱畸精子症(OAT)的射精组、有射精精子记录但因各种原因（如取卵日无法射精、输精管结扎等）而行常规睾丸精子提取(TESE)的睾丸组，以及确诊为非梗阻性无精子症(NOA)且生精功能受损而行显微睾丸精子提取(M-TESE)的睾丸组。这种分组设计巧妙地将睾丸精子区分为“生精功能可能正常”（TESE组）和“生精功能明确受损”（M-TESE组）两种情况，并与射精精子中的“正常”（对照组）和“严重异常”（OAT组）状态进行比较，从而能够更精细地剖析不同来源精子的特性。

研究人员开展这项研究，主要运用了几个关键技术方法。首先是样本的精细处理，特别是对于睾丸组织，他们通过机械分离并在倒置显微镜下用注射针头逐个挑选精子，以最大限度地减少周围组织细胞和红细胞的干扰，提高了后续分析的准确性。其次，他们对精子进行了多维度评估：采用Diff-Quik染色进行详细形态学分析和畸形精子指数(TZI)计算；使用伊红染色评估精子活力；通过精子染色质扩散试验(SCD)即时检测DNA碎片化指数(DFI)；利用PSA-FITC荧光染色评估顶体状态（完整顶体比例）；并采用定量实时聚合酶链反应(qPCR)技术测量相对精子端粒长度(STL)。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件完成，确保了结果的可靠性。

精子参数

研究结果显示，在精子活力方面，OAT组的精子活力显著低于对照组、TESE组和M-TESE组。在精子形态上，对照组的正常形态率显著高于OAT组、TESE组和M-TESE组。更重要的是，TESE组和M-TESE组的正常形态率极低（均值均为0.2%），甚至低于OAT组（均值1.2%）。畸形精子指数(TZI)的分析进一步证实了这一点，对照组的TZI最低，OAT组次之，而两个睾丸精子组（TESE和M-TESE）的TZI最高，表明睾丸精子中每个异常精子所携带的形态缺陷数量最多。

详细精子形态

对具体形态异常部位的深入分析揭示了更细微的差异。与对照组相比，TESE组和M-TESE组的精子头部-中段联合异常的发生率显著更高。此外，残余体的检出率在TESE和M-TESE组中也显著高于对照组和OAT组。这些发现提示睾丸精子可能存在成熟不完全和生精过程受损的问题。

DNA碎片化指数和顶体反应

在核心指标DNA碎片化方面，研究结果出乎意料。对照组的DFI显著低于OAT组、TESE组和M-TESE组。然而，OAT组、TESE组和M-TESE组三者之间的DFI并无显著差异。这意味着，无论是严重异常的射精精子（OAT），还是直接从睾丸获取的精子（无论生精功能可能正常的TESE组还是明确受损的M-TESE组），其DNA损伤水平都处于相似的高位，且均显著高于正常射精精子。这一发现直接挑战了“睾丸精子DNA更完整”的假说。在顶体状态方面，对照组的精子拥有最高比例的完整顶体，显著高于所有实验组。OAT组的完整顶体比例也高于M-TESE组。

相对精子端粒长度

端粒长度的测量结果同样引人注目。M-TESE组（非梗阻性无精子症患者）的精子相对端粒长度显著短于对照组、OAT组和TESE组。这是首次有研究报道睾丸精子，特别是生精功能受损的NOA患者精子中，存在明显的端粒缩短现象。

精子质量参数的相关性分析

Spearman相关性分析揭示了各质量参数之间的内在联系。DFI与正常形态率呈强负相关，与TZI呈正相关。STL与DFI呈负相关，与正常形态率呈正相关。完整顶体比例与DFI负相关，与正常形态率正相关。这些关联表明，精子DNA完整性、形态、端粒长度和顶体状态是相互关联的质量指标，共同反映了精子的内在健康程度。

归纳研究的结论和讨论部分，本研究的重要发现在于它提供了强有力的证据，表明睾丸精子并非想象中的“净土”。其DNA损伤水平与严重异常的射精精子相当，甚至在某些方面（如形态异常、端粒长度）问题更为突出。这提示，精子DNA损伤的主要来源可能并非附睾运输过程中的氧化应激，而是源于睾丸内的生精过程本身，例如凋亡异常、染色质重塑缺陷等。因此，简单地通过睾丸取精来规避射精后损伤，对于大多数非无精子症患者可能并非良策，尤其当损伤根源在于睾丸时，这种做法不仅无效，还可能让患者承受不必要的手术风险。对于非梗阻性无精子症患者，其精子表现出的严重DNA损伤、极短的端粒长度以及高比例的形态异常，可能是其辅助生殖结局较差的重要原因。端粒缩短可能通过影响染色体稳定性，导致非整倍体率增加，从而影响胚胎发育。

综上所述，这项研究对当前男性不育的临床实践提出了重要的反思。它强调，在考虑使用睾丸精子前，应仔细甄别精子DNA损伤的起源（睾丸源性还是睾丸后源性）。对于无精子症患者，在睾丸精子提取和ICSI过程中，采用富含抗氧化剂的培养液和更有效的精子筛选技术，或许有助于改善结局。未来的研究需要进一步探索睾丸精子质量缺陷的深层机制，并开发针对性的干预策略，以最终提高这部分患者的生育成功率。