基于Mtphagy荧光的线粒体生理检测新方法揭示青蒿素诱导疟原虫生长停滞的生存机制

《Scientific Reports》：Fluorescence-based bioassay for the detection of changes in mitochondrial physiology during artemisinin-induced growth arrest of blood-stage Plasmodium falciparum

本研究针对青蒿素(ART)耐药性监测难题，开发了一种基于pH敏感性荧光染料Mtphagy的新型检测方法，用于实时追踪恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)在双氢青蒿素(DHA)诱导生长停滞过程中的线粒体生理变化。研究人员发现DHA处理可显著提高PfDYN1、PfDYN2、PfVDAC和PfATG8基因表达，并通过抑制剂实验证实线粒体分裂和PI3K介导的自噬途径在寄生虫生存中起关键作用。该技术为ART耐药性监测提供了新工具，为克服耐药性提供了新靶点。

　　

在疟疾防治领域，青蒿素及其衍生物作为一线治疗药物正面临严峻的耐药性挑战。特别是恶性疟原虫，这种导致最多死亡病例的疟原虫种类，已在大湄公河次区域和撒哈拉以南非洲地区出现青蒿素耐药现象。耐药机制与Kelch13(K13)基因突变密切相关，但更深层的生物学机制仍需探索。

有趣的是，恶性疟原虫在青蒿素压力下会进入一种特殊的"生长停滞"状态——环状体寄生虫暂时停止发育，降低代谢水平，但保留部分活跃的线粒体功能，以此躲避药物杀伤，待药效过后再恢复生长，导致疟疾复发。这种"假死"状态使得传统显微镜检测难以准确区分生长停滞寄生虫和死亡寄生虫，给耐药性监测带来巨大挑战。

为破解这一难题，泰国玛希隆大学西里拉医院寄生虫学系的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新研究。他们开发了一种基于新型荧光染料Mtphagy的检测方法，首次实现了对青蒿素诱导生长停滞过程中恶性疟原虫线粒体生理变化的实时追踪。

关键技术方法

研究采用青蒿素敏感株K1和耐药株IPC-5202（携带K13 R539T突变）进行实验。通过定量PCR检测线粒体动力学相关基因表达，使用流式细胞术结合Visafe green(VSG)和碘化丙啶(PI)双染色评估寄生虫活力。核心创新在于应用Mtphagy这种线粒体特异性pH敏感性荧光染料，结合MitoTracker Red CMXRos和Lyso染料，通过共聚焦显微镜和三维全息断层扫描技术，实时监测DHA处理后的线粒体生理变化。同时采用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1和PI3K抑制剂wortmannin进行功能验证。

线粒体调控过程参与DHA诱导的生长停滞

研究人员首先检测了DHA暴露后线粒体自噬相关基因的表达变化。结果显示，在DHA处理后，ART敏感株K1和耐药株IPC-5202中PfDYN1、PfDYN2、PfVDAC和PfATG8的转录水平均显著升高。这些基因分别参与线粒体分裂（动力蛋白样蛋白）、线粒体外膜完整性（电压依赖性阴离子通道）和自噬膜形成（自噬相关蛋白8）。当加入Mdivi-1和wortmannin抑制剂后，这些基因的表达均出现下调，表明DHA诱导的环状体生长停滞确实涉及线粒体重塑和降解过程。

Mtphagy染料不影响寄生虫生长

为确保Mtphagy染料适用于活细胞成像，研究团队评估了其对寄生虫生长的细胞毒性。实验发现，无论是在DHA处理前还是处理后进行Mtphagy染色，寄生虫的生长曲线和复苏时间均与未染色对照组无显著差异。流式细胞术分析也证实，Mtphagy染色不影响寄生虫活力，表明该染料适用于活细胞成像分析。

Mtphagy荧光信号与ART暴露后生长停滞相关

共聚焦显微镜图像显示，Mtphagy染料与MitoTracker CMXRos定位于相同位置，证实其在线粒体内的特异性积累。值得注意的是，在DHA暴露的寄生虫中未检测到Lyso染料的荧光信号，但在DMSO对照组中，Mtphagy与MitoTracker信号高度重叠（R=0.8），而DHA处理组中两者重叠区域减少（R=0.6），提示线粒体位置发生改变。

三维全息断层扫描进一步证实，DHA诱导的生长停滞寄生虫中Mtphagy和MitoTracker信号的重叠区域减少，表明线粒体定位发生变化。尽管在人类神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞中验证了Mtphagy染料在溶酶体区室酸化时的荧光增强效应，但在疟原虫中未观察到典型的溶酶体结构，提示DHA诱导的生长停滞可能涉及不完整或异常的线粒体自噬样过程。

Mtphagy染料助力生长停滞疟原虫检测

流式细胞术分析显示，DHA暴露后存活寄生虫中Mtphagy阳性细胞比例显著增加（K1株26.2%，IPC-5202株21.2%），而DMSO对照组分别为18.3%和13.7%。Mtphagy的平均荧光强度(MFI)在DHA处理组也显著升高，表明该染料能有效检测DHA诱导的生长停滞寄生虫。

Mtphagy染料反映线粒体生理变化

通过在不同时间点（早期3小时和晚期18小时）添加Mdivi-1和wortmannin抑制剂，研究人员发现：在早期阶段，Mdivi-1显著降低了Mtphagy阳性细胞比例；而在晚期阶段，两种抑制剂均能显著减少Mtphagy阳性细胞。更重要的是，抑制剂处理延迟了DHA暴露寄生虫的复苏时间，表明线粒体生理变化确实影响寄生虫的生存和恢复能力。

研究结论与意义

本研究首次将Mtphagy这种线粒体特异性pH敏感性荧光染料应用于疟原虫研究，建立了一种新型检测方法，能够实时追踪青蒿素诱导生长停滞过程中的线粒体生理变化。研究发现DHA处理可通过上调PfDYN1、PfDYN2、PfVDAC和PfATG8基因表达，激活线粒体分裂和自噬相关途径，这是寄生虫在药物压力下的一种适应性生存策略。

该研究的创新点在于：1）开发了基于Mtphagy染料的荧光检测方法，克服了传统线粒体染料在生长停滞寄生虫中信号弱的局限性；2）通过三维成像技术揭示了DHA暴露后线粒体定位的动态变化；3）证实了线粒体分裂和PI3K介导的通路在寄生虫生存中的关键作用。

这项研究不仅为青蒿素耐药性监测提供了新的技术工具，也为理解疟原虫在药物压力下的生存机制提供了新视角。针对线粒体动力学的干预策略可能成为克服青蒿素耐药性的新途径，对全球疟疾防控具有重要意义。未来研究可进一步探索线粒体质量控制在青蒿素耐药性中的具体分子机制，为开发新型抗疟药物提供靶点。