MMP-9血凝酶样结构域通过其PEX结构域抑制脂多糖诱导的肝脏白细胞介素-6分泌

《Scientific Reports》：The hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 attenuates lipopolysaccharide-induced interleukin-6 secretion in liver

本研究针对肝内炎症调控机制不明的问题，探讨了基质金属蛋白酶-9（MMP-9）对脂多糖（LPS）诱导的白细胞介素-6（IL-6）分泌的调控作用。研究发现MMP-9通过其血凝酶样（PEX）结构域而非催化活性，显著抑制肝脏和巨噬细胞中LPS诱导的IL-6分泌，为肝脏炎症治疗提供了新靶点。

　　

当细菌感染引发全身性炎症反应时，肝脏作为人体重要的免疫器官，往往成为炎症风暴的中心战场。脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性菌细胞壁的关键成分，能够通过激活Toll样受体4（TLR4）信号通路，引发肝细胞内一系列剧烈的炎症反应。其中，白细胞介素-6（IL-6）作为核心炎症因子，其过度分泌会导致组织损伤甚至器官衰竭。然而，机体内部是否存在天然的"刹车"机制来调控这一过程，一直是科学家们探索的重点。

基质金属蛋白酶-9（MMP-9）作为一种能够降解细胞外基质的蛋白酶，长期以来被认为在炎症反应中扮演着双重角色。有趣的是，先前研究发现MMP-9基因敲除（KO）小鼠在败血症模型中表现出更严重的炎症反应，暗示MMP-9可能具有抗炎潜力。但是，这种保护作用的具体分子机制，特别是在肝脏这一重要免疫器官中的作用方式，仍然笼罩在迷雾之中。

为了解决这一科学难题，由Chien Huang教授领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。他们通过巧妙的实验设计，首次揭示了MMP-9的血凝酶样结构域（PEX）在抑制LPS诱导的肝脏IL-6分泌中的关键作用，这一发现为理解肝脏炎症调控机制提供了全新视角。

在研究过程中，团队综合运用了多种先进技术方法。他们利用MMP-9催化结构域缺陷小鼠模型，通过腹腔注射LPS建立急性炎症模型，检测了血浆和肝脏中炎症因子水平及肝损伤指标。在细胞水平，研究人员通过慢病毒载体系统构建了四环素诱导的MMP-9表达系统，分别在肝细胞系Hepa1-6和巨噬细胞系RAW264.7中实现了MMP-9的精准调控。特别值得一提的是，团队还设计了MMP-9的功能缺失突变体（E402A）和PEX结构域缺失突变体（ΔPEX），从而能够区分MMP-9的催化活性和PEX结构域功能。实验过程中，凝胶酶谱法被用于检测MMP-9的酶活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析了IL-6的分泌水平，而实时定量PCR和蛋白质印迹则分别从转录和翻译水平评估了基因表达情况。

MMP-9缺陷加剧LPS诱导的全身性炎症和小鼠肝损伤

研究人员首先在体内模型中验证了MMP-9的保护作用。与野生型（WT）小鼠相比，MMP-9催化缺陷小鼠在LPS刺激后表现出更严重的全身性炎症反应，具体表现为血浆中IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平显著升高，同时肝损伤标志物丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）也明显上升。组织学分析显示，MMP-9缺陷小鼠肝脏中出现更多免疫细胞浸润，但巨噬细胞标志物F4/80阳性区域无显著差异，表明MMP-9缺失不影响巨噬细胞的招募过程。

MMP-9缺陷加重LPS诱导的肝脏促炎细胞因子产生

深入探究肝脏局部炎症反应发现，MMP-9缺陷小鼠肝脏中IL-6蛋白水平在LPS刺激24小时后显著高于WT小鼠，而TNF-α蛋白水平两组间无差异。在基因表达层面，MMP-9缺陷特异性上调了Il6 mRNA表达，但不影响Tnf和Il1b的转录水平。值得注意的是，MMP-9缺失还导致LPS信号通路相关分子TLR4和CD14表达上调，并增强了核因子κB（NF-κB）的活化，这可能是炎症反应加剧的重要原因。

MMP-9过表达抑制原代肝细胞中LPS诱导的IL-6分泌

为了直接验证MMP-9在肝细胞中的功能，研究团队分离了小鼠原代肝细胞并通过质粒转染实现MMP-9过表达。结果显示，LPS刺激显著促进IL-6分泌，而MMP-9过表达则有效抑制了这一过程，从功能获得角度证实了MMP-9在肝细胞中的抗炎作用。

MMP-9过表达减轻Hepa1-6细胞中LPS诱导的IL-6分泌

为了更精确地调控MMP-9表达，研究人员在Hepa1-6肝细胞系中建立了四环素诱导的MMP-9表达系统。多西环素（Dox）处理后，MMP-9的酶活性、蛋白和mRNA表达均显著诱导，并且MMP-9过表达显著降低了LPS诱导的IL-6分泌。有趣的是，这种调控发生在蛋白质分泌水平，而不影响Il6和Tnf的mRNA表达，提示MMP-9可能通过转录后机制调控IL-6。

血凝酶样结构域对减弱肝细胞中LPS诱导的IL-6分泌至关重要

为了区分MMP-9不同结构域的功能，研究团队构建了催化失活突变体（E402A）和PEX结构域缺失突变体（ΔPEX）。令人惊讶的是，E402A突变体仍能抑制LPS诱导的IL-6分泌，而ΔPEX突变体则完全丧失了这一功能。这表明MMP-9的抗炎作用不依赖于其蛋白酶活性，而是由其PEX结构域介导。

MMP-9过表达减弱RAW264.7细胞中LPS诱导的IL-6分泌

考虑到肝脏中库普弗细胞是炎症因子的重要来源，研究团队在RAW264.7巨噬细胞中验证了MMP-9的功能。与肝细胞中的发现一致，MMP-9过表达显著抑制了LPS诱导的IL-6分泌，而不影响Il6 mRNA水平，进一步证实了MMP-9在不同细胞类型中的类似调控机制。

MMP-9敲除增加LPS诱导的IL-6分泌但不影响基因水平

通过CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞中的MMP-9基因，研究人员从功能缺失角度验证了MMP-9的作用。MMP-9缺失显著增强了LPS诱导的IL-6分泌，但Il6 mRNA水平无变化，再次证实MMP-9在蛋白质分泌水平调控IL-6，而非转录水平。

综合研究结果，本研究发现MMP-9通过其PEX结构域而非催化活性，在肝脏中发挥重要的抗炎功能。这种调控机制在肝细胞和巨噬细胞中均存在，主要通过影响IL-6的分泌过程而非基因转录来实现。值得注意的是，虽然MMP-9在肝细胞中的基础表达较低，但由于肝细胞占肝脏细胞总数的60-70%，其总体贡献不容忽视。

研究的讨论部分指出，虽然MMP-9在肝脏中的主要来源是中性粒细胞，但本研究聚焦于肝实质细胞和巨噬细胞，这两类细胞虽然MMP-9表达量相对较低，但因其数量优势，在肝脏免疫调控中可能发挥重要作用。PEX结构域可能通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP-1）等分子相互作用，调控下游信号通路，从而影响IL-6的分泌过程。

这项研究的重要意义在于首次明确了MMP-9 PEX结构域在肝脏炎症调控中的关键作用，为开发针对肝脏炎症性疾病的新治疗策略提供了理论依据。传统的MMP-9抑制剂主要针对其催化活性，而本研究提示针对PEX结构域的干预策略可能具有更好的特异性和安全性。未来研究需要进一步阐明PEX结构域的具体作用机制及其在慢性肝脏疾病中的潜在应用价值。