多模态客观评估猪角膜缘干细胞缺陷模型：为角膜再生疗法研究提供新平台

《Scientific Reports》：Multimodal objective assessment of a porcine limbal stem cell deficiency model for corneal therapy research

为解决角膜缘干细胞缺陷(LSCD)缺乏可靠且客观的临床前评估模型这一难题，研究人员开展了一项关于猪LSCD模型的多模态客观评估研究。他们通过全角膜上皮刮除术成功诱导LSCD，并利用连续前段光学相干断层扫描(OCT)和计算机辅助数字病理学进行客观量化。研究结果表明，该模型能稳定复制LSCD的病理特征，且通过OCT和数字病理学获得的客观指标能有效区分健康与病变角膜。这一研究为角膜再生疗法（如ATMPs）的临床前测试提供了可重复、无偏倚的评估平台，具有重要的转化医学价值。

　　

在眼科领域，角膜缘干细胞缺陷(Limbal Stem Cell Deficiency, LSCD)是一种严重的致盲性眼病。当位于角膜边缘的“种子细胞”——角膜缘干细胞受损时，角膜便失去了自我更新的能力，导致结膜组织长入角膜，引发血管化、瘢痕化和视力丧失。目前，角膜移植是主要的治疗手段，但供体来源有限，且对于LSCD患者，单纯移植角膜往往效果不佳，因为缺乏健康的干细胞来维持角膜的长期透明。因此，以干细胞为基础的再生疗法，如角膜缘干细胞移植或诱导多能干细胞(iPSC)来源的细胞治疗，成为了研究热点。

然而，任何新疗法的诞生都离不开可靠的临床前动物模型。目前，LSCD研究主要依赖兔模型。虽然兔眼在眼科研究中应用广泛，但其与人类在角膜结构、炎症反应和新生血管化等方面存在显著差异，这限制了研究结果向临床转化的可靠性。猪眼在大小、解剖结构和再生机制上与人类更为相似，是理想的替代模型。但在此之前，文献中尚未有关于猪LSCD模型的系统报道。

除了模型本身，评估角膜再生的方法也存在挑战。传统的评估多依赖于临床观察（如荧光素染色）和主观的病理学评分，这些方法容易受到观察者偏倚的影响，缺乏客观性和可重复性。因此，开发一种能够客观、量化地评估角膜再生过程的模型和方法，对于推动角膜再生医学的发展至关重要。

为了填补这一空白，来自波兰西里西亚医科大学等机构的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项研究。他们成功建立了首个猪LSCD模型，并创新性地将两种强大的客观评估技术——连续前段光学相干断层扫描(Anterior-Segment Optical Coherence Tomography, OCT)和计算机辅助数字病理学(Digital Pathology)相结合，为角膜再生研究提供了一个无偏倚、可量化的评估平台。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，他们选取了4头家猪，通过手术方式对其右眼进行全角膜上皮刮除术，以模拟LSCD，左眼则作为对照。其次，他们利用前段OCT在术前、术后即刻以及术后第5至28天的多个时间点对猪眼进行连续成像，以无创、实时地监测角膜厚度和结构的变化。最后，在实验终点（术后28天），他们获取角膜组织，进行常规组织学（H&E、Masson三色染色）和免疫组织化学（细胞角蛋白-3, Cytokeratin-3, CK3）染色，并利用数字病理学软件对组织切片进行全自动分析，量化了上皮厚度、表面粗糙度以及上皮和基质细胞密度等关键参数。

角膜损伤与再生

研究人员通过手术成功移除了猪角膜的上皮，荧光素染色和OCT成像均证实了上皮的完全去除。在28天的观察期内，角膜经历了逐步的再生过程。OCT的定量分析显示，角膜基质在术后立即出现显著水肿，并在术后第7-9天达到峰值，随后逐渐消退。然而，直到实验结束时，角膜厚度仍未完全恢复到基线水平，表明损伤后的角膜重塑是一个持续的过程。

组织学评估与数字病理学评价

组织学检查揭示了LSCD的典型病理特征。与健康对照相比，实验组角膜上皮出现了显著的结构紊乱，表现为局部区域的增厚和变薄。增厚区域表现为上皮层数增多，而变薄区域则表现为细胞层数减少和表层角化。免疫组织化学染色显示，实验组角膜上皮的细胞角蛋白-3(CK3)表达呈斑片状和不规则状，基底细胞中CK3表达缺失，这表明角膜上皮的正常分化过程受到了破坏。角膜缘区域也出现了病理改变，包括角膜缘隐窝（干细胞巢）的结构紊乱、炎症细胞浸润和新生血管形成。角膜基质同样发生了重塑，表现为胶原纤维排列紊乱、炎症细胞浸润和血管侵入。

数字病理学的自动化分析进一步提供了客观的量化证据。分析结果显示，与对照组相比，实验组角膜上皮的表面粗糙度（最大轮廓高度Rz）和厚度异质性显著增加。此外，实验组角膜基质中的细胞密度也显著高于对照组，这反映了损伤后基质中发生的炎症反应和细胞浸润。这些客观指标能够清晰地将LSCD角膜与健康角膜区分开来。

研究结论与讨论

这项研究成功建立并验证了首个猪LSCD模型。该模型能够稳定地复制出与人类LSCD相似的病理特征，包括角膜缘干细胞巢的破坏、炎症浸润、新生血管化以及角膜上皮分化异常。更重要的是，研究团队引入了一套客观、无偏倚的评估体系。通过连续OCT成像，研究人员能够无创、实时地监测角膜的再生过程；而通过数字病理学的自动化分析，他们能够精确量化组织学层面的细微变化，如上皮表面粗糙度和基质细胞密度。

这项研究的意义在于，它为角膜再生疗法的临床前研究提供了一个强大的平台。无论是角膜缘上皮细胞、iPSC来源的细胞，还是间充质基质细胞等先进治疗药物(Advanced Therapy Medicinal Products, ATMPs)，都可以在这一与人类高度相似的猪眼模型中进行测试。通过结合OCT和数字病理学这两种客观的评估方法，研究人员能够更精确、更可靠地评估新疗法的有效性和安全性，从而加速这些创新疗法从实验室向临床的转化，最终为LSCD患者带来新的希望。