鸟博德特菌噬菌体抗性通过改变细胞壁导致对多肽抗生素多粘菌素E和B敏感性增加的机制研究

《Scientific Reports》：Phage resistance of Bordetella avium due to an altered cell wall results in increased susceptibility to the polypeptide antibiotics colistin and polymyxin B

本研究针对禽类呼吸道病原体鸟博德特菌(Bordetella avium)面临抗生素耐药性日益严重的问题，探索了其噬菌体抗性突变与抗生素敏感性之间的关联。研究人员发现，噬菌体抗性突变导致细菌脂多糖(LPS)结构改变，进而使其对多肽类药物多粘菌素E(CST)和B(PMB)的敏感性显著提高。这一发现为开发噬菌体-抗生素联合疗法提供了新思路，具有重要的临床转化潜力。

　　

在禽类养殖业中，由鸟博德特菌(Bordetella avium)引起的博德特菌病是一种常见的呼吸道疾病，导致全球商业化养禽场遭受重大经济损失。目前主要依赖大环内酯类、四环素类、甲氧苄啶-磺胺类药物组合和氟喹诺酮类等抗菌药物进行治疗。然而，随着抗生素耐药性的日益严重，寻找替代疗法迫在眉睫。

噬菌体疗法作为一种有前景的替代方案备受关注，但其面临的主要挑战之一是细菌会迅速产生噬菌体抗性。与抗生素类似，细菌也能进化出对抗噬菌体的机制，这限制了噬菌体疗法的长期有效性。因此，深入了解细菌产生噬菌体抗性的分子机制及其对细菌生物学特性的影响，对于开发有效的抗菌策略至关重要。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，德国吉森大学兽医医学院的研究团队深入探讨了鸟博德特菌产生噬菌体抗性的机制，并意外发现这种抗性会带来一个有益的"副作用"—使细菌对某些抗生素更加敏感。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。他们从禽类环境中分离的50株鸟博德特菌野分离株和标准菌株中，通过噬菌体感染筛选获得了噬菌体抗性突变体。利用全基因组测序技术比较了亲本菌株和突变体之间的遗传差异，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了脂多糖(LPS)结构变化，采用琼脂稀释法进行抗菌药物敏感性测试，并通过吸附实验和互补实验验证了基因功能。此外，还通过游动性实验和生长竞争实验评估了突变体的生物学特性。

结果

噬菌体抗性突变体的分离和表征

研究人员从先前清晰的裂解斑中分离出能在噬菌体存在下生长的单菌落，鉴定出四株噬菌体抗性鸟博德特菌突变体。这些突变体对七种鸟博特菌噬菌体(vB_BaM-IFTN1-7)均表现出抗性，但生长特性与亲本菌株无显著差异。竞争实验表明，在混合培养中，噬菌体抗性突变体并未被亲本菌株显著淘汰。

噬菌体抗性突变体的LPS分析

SDS-PAGE分析显示，所有噬菌体抗性突变体均表现出LPS结构改变，缺失了O-抗原部分，转化为粗糙型LPS。与亲本菌株相比，突变体的LPS在凝胶中迁移更快，表明多糖链缩短。

吸附减少导致鸟博特菌突变体的噬菌体抗性

吸附实验表明，噬菌体在抗性突变体上的吸附率显著降低，表明LPS结构改变阻碍了噬菌体与细菌受体的特异性结合，这是导致噬菌体抗性的主要原因。

鸟博特菌菌株及其噬菌体抗性突变体的比较基因组学

全基因组测序分析发现，所有突变均位于与LPS生物合成相关的基因中，包括BAV2233和BAV2235(编码糖基转移酶家族4蛋白)以及BAV0511(编码Vi多糖生物合成UDP-N-乙酰葡糖胺C-6脱氢酶TviB蛋白)。互补实验证实这些突变确实导致噬菌体抗性表型。

鸟博特菌噬菌体抗性突变体的游动性降低

游动性实验显示，大多数噬菌体抗性突变体游动能力显著降低，其中x1760R突变体完全丧失游动能力，表明LPS改变影响了细菌的运动性。

噬菌体抗性鸟博特菌突变体对多肽抗生素的敏感性增加

药敏试验显示，噬菌体抗性突变体对多粘菌素E(Colistin, CST)和多粘菌素B(Polymyxin B, PMB)的敏感性显著提高，最低抑菌浓度(MIC)值降低了高达16倍。这种敏感性增加与LPS多糖链长度相关，链越短，敏感性越高。

LPS在鸟博特菌对多粘菌素E和多粘菌素B敏感性中的作用

研究人员发现，虽然大多数噬菌体抗性突变体对多肽抗生素敏感性增加，但存在一小部分突变体(选择频率约为3.78×10^-4)同时保持噬菌体抗性和相对较低的抗生素敏感性。这些突变体的LPS结构分析表明，其对抗生素的敏感性取决于LPS多糖链的长度。

通过药敏试验检测膜通透性

研究人员还测试了突变体对利福平(Rifampicin)和新霉素(Novobiocin)的敏感性，发现只有严重截短LPS内核的突变体(如CCUG 13726T△BAV2230)对这些抗生素的敏感性显著增加，表明LPS内核在维持外膜屏障功能中起关键作用。

讨论与结论

本研究系统阐述了鸟博特菌通过改变LPS结构产生噬菌体抗性的分子机制，并发现这种改变会显著增加细菌对多肽抗生素多粘菌素E和B的敏感性。这一发现具有重要的理论和实践意义。

首先，研究揭示了噬菌体抗性可能与抗生素敏感性之间存在权衡关系(trade-off)，这为开发噬菌体-抗生素联合疗法提供了理论依据。在这种策略中，噬菌体治疗不仅直接裂解细菌，还可能选择出对抗生素更加敏感的突变体，从而增强抗生素的疗效。

其次，研究详细阐述了不同LPS生物合成基因突变对细菌表型的影响。突变基因的功能分析不仅解释了噬菌体抗性的机制，也揭示了LPS结构完整性在细菌对抗环境压力中的重要作用。

值得注意的是，虽然噬菌体抗性突变体在某些方面(如游动性)存在缺陷，但在标准实验室条件下，它们的生长能力并未受到显著影响。这表明在自然环境中，这类突变体可能具有一定的生存优势，不会迅速被淘汰。

此外，LPS结构的改变可能影响细菌的致病性。已有研究表明，光滑型LPS比粗糙型LPS具有更强的促炎活性，因此噬菌体抗性突变体可能毒力减弱，这进一步增强了噬菌体疗法的安全性。

本研究的结果，结合先前关于鸟博特菌噬菌体不产生超感染免疫、不传播耐药性和毒力基因的发现，表明针对鸟博特菌的噬菌体疗法具有广阔前景。然而，由于本研究使用的为温和型噬菌体，不适合直接临床应用，因此开发基于这些噬菌体的基因工程噬菌体可能是未来的重要方向。

总体而言，这项研究不仅增进了我们对细菌-噬菌体相互作用的理解，也为应对抗生素耐药性挑战提供了新的思路，特别是在禽类呼吸道感染的防控方面具有潜在应用价值。通过巧妙利用细菌进化中的权衡关系，可能为开发更有效的抗菌策略开辟新途径。