乳酸化修饰与成纤维细胞亚群协同调控肝内胆管癌恶性进展的机制及预后模型构建

《Scientific Reports》：Integrative analysis of scRNA-seq and RNA-seq to investigate the prognostic value of lactylation and fibroblast-related genes in intrahepatic cholangiocarcinoma

本研究针对肝内胆管癌(ICCA)预后差、缺乏有效靶点的问题，通过整合单细胞测序与转录组数据，揭示了抗原呈递型癌症相关成纤维细胞(apCAFs)与血管型CAFs(vCAFs)间CXCL12-CXCR4信号轴的关键作用。研究构建了基于STMN1、UBE2T、CENPF、C5orf34和FAM72C的5基因预后风险模型，并证实其与细胞周期、氧化磷酸化通路及免疫微环境重塑密切相关。该研究为ICCA的预后评估和靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。

　　

肝内胆管癌(ICCA)是仅次于肝细胞癌的第二大原发性肝癌，近年来其全球发病率和死亡率持续攀升。由于早期症状隐匿，大多数患者确诊时已处于晚期，即使接受根治性手术，5年生存率仍低于30%，复发率高达60%-70%。ICCA的发病机制复杂，涉及多种遗传和表观遗传改变，以及肿瘤微环境(TME)中复杂的相互作用。尽管有手术、放疗、化疗和靶向治疗等选择，但其疗效有限，尤其是在晚期患者中。因此，深入揭示ICCA进展的分子机制，寻找可靠的预后生物标志物，对于改善患者临床结局至关重要。

乳酸，曾被认为是单纯的代谢废物，如今被证实是一种信号分子，通过一种新型的组蛋白翻译后修饰——乳酸化，将糖酵解与表观遗传调控联系起来。乳酸在肿瘤中的积累，通过组蛋白乳酸化调节基因表达，促进肿瘤进展。在ICCA中，乳酸诱导的组蛋白乙酰化已被证明能促进细胞增殖、免疫逃逸和基质重塑。此外，肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞(CAFs)作为肿瘤基质的关键成分，对肿瘤增殖、转移和治疗抵抗具有深远影响。CAFs具有异质性，其中抗原呈递型CAFs(apCAFs)能够激活CD4⁺T细胞并影响免疫反应。因此，全面了解成纤维细胞在ICCA中的多样化作用，对于开发新的治疗策略至关重要。

为了回答这些问题，研究人员开展了一项整合性研究，旨在探索与ICCA预后相关的乳酸化调控机制和成纤维细胞亚群。该研究整合了单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据、TCGA-ICCA队列的转录组数据以及GSE107943数据集，并筛选了组蛋白乳酸化相关基因(LRGs)。通过细胞间通讯分析、预后建模、免疫浸润分析、调控网络构建、药物敏感性分析以及RT-qPCR验证等多种方法，研究人员系统性地揭示了乳酸化在ICCA中的关键作用，并识别了新的治疗和预后靶点。

主要技术方法

本研究主要整合了多组学数据进行分析。数据来源包括：GSE138709数据集（包含5例ICCA肿瘤样本和3例癌旁正常组织的单细胞RNA测序数据）、TCGA-ICCA数据库（包含36例ICCA肿瘤组织和9例癌旁正常组织的转录组数据及临床信息）以及GSE107943数据集（包含30例ICCA肿瘤样本和27例癌旁正常组织样本）。研究首先对单细胞数据进行质控、降维和细胞亚群注释，重点关注成纤维细胞亚群。随后，通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选关键基因模块。利用LASSO回归和Cox回归构建预后风险模型，并通过Kaplan-Meier生存曲线和受试者工作特征(ROC)曲线评估模型性能。此外，研究还进行了基因集富集分析(GSEA)、基因集变异分析(GSVA)、免疫细胞浸润分析、转录因子调控网络预测、药物敏感性预测以及细胞轨迹分析。最后，通过RT-qPCR在10例临床组织样本（5例ICCA肿瘤组织，5例癌旁正常组织）中对关键基因的表达进行了验证。

研究结果

1. 成纤维细胞亚群鉴定与细胞通讯分析

研究人员首先对单细胞测序数据进行了分析，共获得33,991个细胞和19,813个基因。经过降维和聚类，识别出12个细胞亚群，并注释为8种不同的细胞类型，其中包括成纤维细胞。进一步分析将成纤维细胞划分为5个亚群，分别注释为CAFs、肌成纤维样CAFs(mCAFs)、血管型CAFs(vCAFs)、炎症型CAFs(iCAFs)和抗原呈递型CAFs(apCAFs)。细胞间通讯分析显示，apCAFs与vCAFs之间的CXCL12-CXCR4配体-受体对相互作用最为显著，提示该信号轴在ICCA中可能发挥重要作用。

2. 差异表达基因筛选与关键模块识别

在apCAFs中，研究人员共鉴定出906个差异表达基因(DEGs1)，其中860个上调，46个下调。在TCGA-ICCA数据集中，共鉴定出6,790个差异表达基因(DEGs2)，其中4,138个上调，2,652个下调。通过WGCNA分析，研究人员发现红色模块与乳酸化相关基因(LRGs)评分的相关性最高(r = -0.744, p < 0.001)，因此将其确定为关键模块，并从中筛选出588个LRG相关基因。通过韦恩图分析，最终确定了14个候选基因用于后续分析。

3. 预后风险模型的构建与验证

为了识别具有预测意义的预后基因，研究人员利用TCGA-ICCA队列的36个样本进行了回归分析。通过LASSO回归和多元Cox回归分析，最终确定了5个预后基因：STMN1、UBE2T、CENPF、C5orf34和FAM72C。基于这5个基因构建的风险评分公式为：风险评分 = STMN1 × 0.1991 + UBE2T × 0.2246 + CENPF × (-0.0374) + C5orf34 × 0.5614 + FAM72C × 0.8908。根据风险评分将患者分为高风险组和低风险组，Kaplan-Meier生存分析显示，高风险组患者的预后显著差于低风险组。ROC曲线分析表明，该模型在1年、2年、3年和5年时间点的曲线下面积(AUC)均超过0.6，显示出良好的预测准确性。该模型在独立的GSE107943数据集（30个ICCA样本）中也得到了验证，证实了其稳定性和可靠性。

4. 功能富集与免疫微环境分析

为了探索5个预后基因的生物学功能，研究人员进行了基因集富集分析(GSEA)。结果显示，C5orf34、CENPF、FAM72C和STMN1在帕金森病和氧化磷酸化通路中富集。GSVA富集分析进一步揭示了高风险组和低风险组之间的通路差异。高风险组中上调的HALLMARK通路主要富集在E2F靶点通路，而上调的KEGG通路主要富集在DNA复制。免疫微环境分析发现，高风险组的免疫细胞浸润水平显著低于低风险组。相关性分析显示，FAM72C与浆细胞样树突状细胞呈负相关(cor = -0.355)，而CENPF与肥大细胞呈负相关(cor = -0.386)。

5. 药物敏感性预测与细胞轨迹分析

药物敏感性分析预测了10种候选化合物在高风险组和低风险组之间的IC50值存在显著差异，包括AZD6482、BX-795、比卡鲁胺、CCT018159、CHIR-99021、GDC0941、GW-441756、PAC-1、S-三苯甲基-L-半胱氨酸和SB-216763。细胞轨迹分析揭示了成纤维细胞内的分化差异，发现apCAFs和CAFs主要分布在细胞分化的早期阶段，而vCAFs则主要分布在后期阶段。

6. 基因表达验证

为了验证预后基因的表达水平，研究人员通过RT-qPCR检测了10例临床组织样本（5例ICCA肿瘤组织，5例癌旁正常组织）中5个基因的表达。结果显示，与对照组相比，ICCA组织中STMN1、UBE2T、CENPF和FAM72C的表达显著上调，而C5orf34在对照组中表达水平更高。这一结果与生物信息学分析一致，进一步证实了这些基因在ICCA中的表达模式。

结论与讨论

本研究通过整合单细胞测序和转录组数据，系统性地揭示了乳酸化相关基因和成纤维细胞亚群在ICCA中的关键作用。研究构建并验证了一个包含STMN1、UBE2T、CENPF、C5orf34和FAM72C的5基因预后风险模型，该模型能够有效预测ICCA患者的预后。功能富集分析表明，这些基因共同参与了细胞周期调控和氧化磷酸化通路，揭示了其驱动ICCA恶性进展的核心分子机制。

STMN1是一种细胞质磷蛋白，通过调节微管动力学在细胞周期中发挥核心作用。UBE2T是一种泛素结合酶，在多种癌症的发生发展中起关键作用。CENPF是一种微管相关蛋白，在染色体分离和胞质分裂中发挥关键作用。FAM72C是一个蛋白编码基因，在多种癌症中被认为是预后不良的预测因子。C5orf34在多种恶性肿瘤中过表达，并与患者预后不良相关。

该研究不仅为ICCA提供了新的预后生物标志物，也为开发针对代谢-表观遗传串扰的精准治疗策略奠定了理论基础。然而，本研究也存在一定的局限性，例如样本量相对较小，未来需要整合多中心、大样本的数据集来进一步验证这些预后基因的临床相关性和调控机制。