哺乳动物适应性PB2突变增强牛源H5N1禽流感病毒聚合酶活性及致病性

《Nature Communications》：Emergence of mammalian-adaptive PB2 mutations enhances polymerase activity and pathogenicity of cattle-derived H5N1 influenza A virus

近期H5N1高致病性禽流感病毒溢出至奶牛并引发人间感染，其跨种传播的分子机制亟待阐明。中国科学院微生物研究所邓涛和高福团队聚焦病毒聚合酶关键亚基PB2，系统鉴定了在禽-牛传播及后续适应过程中出现的关键突变（如M631L）。研究发现PB2 M631L能显著增强病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性，并在小鼠模型中展现出与经典E627K突变相当的致病性。该研究通过回顾性分析揭示PB2 631L变异在2013-2014年柬埔寨/越南H5N1疫情中已参与人畜共患传播，强调了持续监测牛群及哺乳动物宿主中适应性突变对预警流感大流行风险的重要性。

　　

2024年3月，高致病性H5N1禽流感病毒（clade 2.3.4.4b）在美国奶牛场引发大规模疫情，并随后波及多种哺乳动物及人类，标志着H5N1流行史进入新阶段。病毒跨物种传播能力的增强背后隐藏着怎样的分子演化密码？其如何突破宿主限制在哺乳动物细胞中高效复制？这些问题对评估其大流行潜力至关重要。长期以来，流感病毒聚合酶（由PB2、PB1、PA亚基组成）的宿主适应性突变被认为是病毒突破种间屏障的关键。其中，PB2蛋白的E627K突变是最著名的哺乳动物适应性标志之一，但近年来的疫情提示可能存在其他尚未充分认识的关键突变。发表于《Nature Communications》的这项研究，系统揭示了牛源H5N1病毒在传播过程中获得的PB2哺乳动物适应性突变如何增强其聚合酶活性和致病性，并为理解病毒演化提供了重要线索。

研究团队运用了多项关键技术方法：包括利用GISAID数据库进行大规模病毒基因组序列生物信息学分析；采用病毒微型复制子系统（mini-replicon assay）在293T细胞中评估病毒聚合酶活性；通过反向遗传学技术（reverse genetics）拯救重组病毒；使用BALB/c小鼠模型进行体内致病性实验；并利用ANP32基因敲除细胞系（293T TKO）研究病毒聚合酶与宿主蛋白的相互作用。

系统鉴定在禽-牛传播过程中增强哺乳动物细胞聚合酶活性的关键突变

研究人员选取代表性牛源毒株A/dairy cow/Ohio/078707-24-12/2024 (cowOH12-H5N1)和禽源毒株A/chicken/Maine/24-007946-001/2024 (chMA01-H5N1)进行对比。通过微型复制子实验发现，牛源H5N1病毒的聚合酶在哺乳动物细胞中活性显著高于禽源病毒。通过亚基替换实验证实，PB2蛋白是决定这种活性差异的主要因素。序列比对发现两个毒株PB2蛋白存在13个氨基酸差异，其中PB2 M631L单点突变即可使禽源病毒聚合酶活性提升23.3倍。此外，A129T、V495I和V649I等突变也能增强活性，当与M631L组合时，可使禽源病毒聚合酶活性达到牛源病毒水平。

PB2 M631L突变曾在2013-2014年柬埔寨和越南疫情中共同出现于禽类和人类H5N1病毒分离株

回顾性分析发现，PB2 631L变异不仅出现在2024年美国牛群相关疫情中，早在2013-2014年柬埔寨和越南的H5N1疫情中就已存在于人类和禽类病毒中。2013-2014年间，柬埔寨报告了35例人感染H5N1病例，占该国2005年以来总病例数的47%，且所有人类分离株均携带PB2 M631L突变，而经典的E627K突变在这些病例中缺失。系统发育分析显示，携带PB2 631L的病毒形成一个单系群，其中人类分离株与禽类病毒聚类，支持了禽-人传播假说。

PB2 M631L突变赋予小鼠高致病性，与经典哺乳动物适应性PB2 627K突变相当

通过反向遗传学构建重组病毒进行小鼠实验发现，携带PB2 631L的病毒可引起严重疾病和小鼠死亡，其致病性与E627K突变病毒相当。而将631L回复突变为631M后，病毒毒力显著减弱。同时携带E627K和M631L的病毒表现出更强的毒力。肺组织病毒载量测定和组织病理学分析结果与上述表型一致。

持续的H5N1疫情促进PB2中出现更多哺乳动物适应性突变

对2025年3月31日前获得的3028条牛源H5N1病毒PB2序列分析发现，除M631L外，E627K、Q591R、D701N等已知哺乳动物适应性突变出现频率增加，还发现了I647V、G685R、K736R等新突变。功能实验表明，这些突变均能增强聚合酶活性。从感染猫科动物分离的病毒中发现的K736R突变也能增强聚合酶活性。

H5N1病毒在牛和其他哺乳动物传播中产生的PB2适应性突变促进病毒聚合酶利用牛和人类ANP32蛋白

机制研究表明，牛和人的ANP32A/B蛋白能支持牛源H5N1病毒聚合酶活性，但支持效率低于禽类ANP32A。结构分析显示，大多数适应性突变位于聚合酶与ANP32蛋白相互作用的界面附近，通过增强与哺乳动物ANP32蛋白的静电相互作用，促进病毒在哺乳动物细胞中的复制。

哺乳动物适应性PB2突变增加牛源H5N1病毒对小鼠的致病性

小鼠致病性实验系统评估了多种PB2突变的影响。结果显示，Q591R、D701N、D740N等已知突变以及新发现的I647V、G685R和K736R突变均能增强病毒毒力，其中I647V突变病毒导致感染后5天内全部死亡，与E627K突变病毒相当。

研究结论与讨论部分强调，H5N1 clade 2.3.4.4b病毒正在牛群和其他哺乳动物中快速积累哺乳动物适应性PB2突变，这些突变通过增强病毒聚合酶利用哺乳动物ANP32蛋白的能力，提高了病毒在哺乳动物中的复制效率和致病性。PB2 M631L作为一个关键的适应性突变，不仅在当前疫情中发挥作用，早在2013-2014年东南亚疫情中就已参与跨种传播。病毒在哺乳动物中的持续传播为积累更多适应性突变（如HA受体结合偏好改变）提供了进化平台，增加其大流行潜力。因此，加强对关键适应性突变的靶向监测，结合对新兴变异株的功能表征和实施前瞻性防控策略，对缓解人畜共患传播威胁至关重要。