SARS-CoV-2融合肽自组装机制揭秘：螺旋纤维储存机械能驱动膜融合

《Nature Communications》：Insights into the self-assembly and interaction of sars-cov-2 fusion peptides with biomimetic plasma membranes

为解决SARS-CoV-2病毒如何利用其融合肽(FP)驱动病毒与宿主细胞膜融合这一关键科学问题，研究人员开展了关于SARS-CoV-2融合肽自组装及其与仿生质膜(PM)相互作用的研究。该研究揭示了FP1、FP2和FP4三种融合肽在膜界面形成不同的超分子结构，其中FP2形成的螺旋纤维能够储存弹性势能，在膜压缩时释放能量以驱动膜融合。这一发现不仅阐明了病毒入侵的“加载弹簧”机制，也为设计抗病毒药物和响应性纳米材料提供了新思路。

　　

自2019年底以来，由SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型）引发的COVID-19（新型冠状病毒肺炎）疫情迅速演变为一场全球性的健康危机。这种病毒之所以能成功入侵人体细胞，其表面的刺突蛋白（Spike protein）扮演了关键角色。刺突蛋白的S2亚基含有一段被称为“融合肽”（Fusion Peptide, FP）的区域，它如同病毒的“钥匙”，负责与宿主细胞膜结合并启动融合过程，最终将病毒的遗传物质送入细胞内部。

尽管科学家们已经知道融合肽对于病毒入侵至关重要，但一个核心的谜团仍未完全解开：这些短小的肽段究竟是如何在分子水平上精确地“撬开”细胞膜，并完成融合的？传统的观点认为，融合肽可能只是简单地插入膜中，通过破坏脂质双分子层的稳定性来促进融合。然而，越来越多的证据表明，融合肽的行为可能远比这复杂。它们可能通过自组装形成特定的超分子结构，以一种更高效、更协同的方式完成膜融合。

为了深入探究这一过程，一个由Nisha Pawar、Andreas Santamaria、Brigida Romano、Krishna C. Batchu、Valerie Laux、Eduardo Guzman、Nathan. R. Zaccai、Alberto Alvarez-Fernandez和Armando Maestro组成的研究团队，在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表了一项突破性的研究。他们利用多种前沿的生物物理技术，首次揭示了SARS-CoV-2融合肽在模拟细胞膜上自组装成不同形态的超分子结构，并发现其中一种螺旋状的纤维结构能够像“弹簧”一样储存机械能，在关键时刻释放出来驱动膜融合。这一发现不仅为理解病毒入侵机制提供了全新的视角，也为开发新型抗病毒药物和设计智能生物材料奠定了理论基础。

关键实验方法

为了精确解析融合肽与细胞膜的相互作用，研究人员采用了多种高精度的生物物理技术，构建了一个从宏观性质到微观结构的完整研究体系。他们首先构建了模拟真核细胞质膜（Plasma Membrane, PM）外叶的脂质单层模型，该模型包含了磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、鞘磷脂（SM）和胆固醇（Cholesterol）等关键组分，以真实反映细胞膜的物理化学环境。随后，他们将三种不同的SARS-CoV-2融合肽（FP1, FP2, FP4）分别加入该模型，并利用朗缪尔-布洛杰特（Langmuir-Blodgett, LB）槽技术对单层膜进行单轴压缩，以模拟膜融合过程中脂质分子紧密堆积的状态。

在压缩过程中，研究人员通过表面压力-面积（Π-A）等温线测量了单层膜的宏观力学性质，并计算了压缩弹性模量（C_s^-1）。为了揭示分子在膜内的分布和结构，他们运用了掠入射X射线衍射（Grazing-Incidence X-ray Diffraction, GIXD）来探测脂质和肽段的平面内分子排列和有序度，同时利用中子反射（Neutron Reflectometry, NR）技术精确测量了肽段在膜内的插入深度和分布。为了直观地观察膜表面的形貌和肽段的自组装结构，他们将单层膜转移到云母基底上，利用原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）进行了高分辨率的形貌和粘附力成像。此外，他们还通过激光直接红外光谱（Laser Direct Infrared, LDIR）分析了肽段在膜环境下的二级结构变化，从而将宏观的组装行为与微观的分子构象联系起来。

研究结果

融合肽对质膜外叶脂质堆积的影响

研究人员首先通过表面压力-面积（Π-A）等温线研究了融合肽对模拟质膜（PM）单层膜相行为的影响。结果显示，在无肽段存在时，PM单层膜在低表面压力下处于液态扩张相（Liquid-Expanded, LE），随着压缩，在约20 mN/m处发生相变，转变为更有序的凝聚相（Condensed, C）。然而，当加入FP1、FP2或FP4后，等温线均向更大的分子面积方向移动，表明肽段插入了单层膜，破坏了脂质的紧密堆积。其中，FP1和FP4引起的扩张更为显著，表明它们与膜的相互作用更强。压缩弹性模量（C_s^-1）的计算结果进一步证实，在融合肽存在下，单层膜在整个压力范围内都保持了较高的流动性，无法形成紧密的凝聚相，这揭示了融合肽通过干扰脂质堆积来增加膜流动性的基本机制。

为了更精细地观察脂质在平面内的排列，研究人员利用掠入射X射线衍射（GIXD）进行了分析。在20 mN/m和35 mN/m两个压力点下，PM单层膜均显示出两个衍射峰：一个位于q_xy≈ 1.20 ?^-1，对应于胆固醇富集区域的六方晶格排列；另一个位于q_xy≈ 1.52 ?^-1，对应于磷脂酰胆碱（PC）等脂质酰基链的六方排列。有趣的是，在加入FP1和FP2后，磷脂酰链的衍射峰强度显著减弱，而胆固醇的衍射峰保持不变。这表明FP1和FP2主要破坏了磷脂酰链的有序排列，但对胆固醇富集的区域影响较小，这与理论预测的融合肽优先与磷脂而非胆固醇相互作用的观点一致。

原子力显微镜揭示压缩下的脂质组织相行为

为了直观地观察膜表面的形貌，研究人员利用原子力显微镜（AFM）对转移到云母基底上的PM单层膜进行了成像。在20 mN/m（LE相）下，AFM图像显示膜表面存在明显的相分离，呈现出明亮的液态有序相（Liquid-Ordered, Lo）和暗色的液态无序相（Liquid-Disordered, Ld）共存的状态。当压力增加到35 mN/m（C相）时，明亮的Lo区域变得更小、更密集，且分布更加随机。这表明压缩不仅增加了脂质分子的堆积密度，还改变了相分离的形态，使得Lo区域在空间上变得更加破碎。

融合肽在质膜单层膜上的自组装

FP1：形成刚性的线性肽纤维

在20 mN/m的压力下，AFM图像清晰地显示，FP1在PM单层膜上自组装形成了长达100-700纳米的纳米纤维。这些纤维的高度约为1.0 ± 0.2 nm，表明肽段骨架平行于膜表面排列，并部分插入到脂质酰基链区域。然而，当压力增加到35 mN/m时，这些纤维状结构几乎完全消失，膜表面变得均质化。这表明在紧密堆积的膜环境中，FP1无法维持其纤维状组装，而是更深地插入膜内，可能扮演着将病毒复合物锚定在宿主膜上的角色。

FP2：扭曲成螺旋状柔性纳米纤维

与FP1不同，FP2在20 mN/m的压力下形成了独特的螺旋状组装体。这些螺旋纤维具有高度的柔性，其持久长度（Persistence length, L_p）仅为0.14 ± 0.01 μm，远低于FP1纤维的2.32 ± 0.30 μm。这种柔性与FP2的氨基酸序列有关，其含有的带电和极性残基破坏了β-折叠的稳定性，导致纤维易于弯曲。研究人员估算，这些螺旋结构能够储存约17 kcal/mol的弹性势能，这一能量值接近克服半融合（Hemifusion）能垒所需能量的一半。当压力增加到35 mN/m时，这些螺旋结构发生了解组装，释放了储存的机械能，从而驱动膜的重塑。这一过程类似于一个“加载弹簧”的机制。

FP4：静电稳定且结构坚韧的纤维

FP4由于整体带正电，与带负电的磷脂头基团有很强的静电相互作用。AFM图像显示，在20 mN/m下，FP4诱导了相分离，形成了富含平行排列肽纤维的区域和富含脂质的区域。与FP1和FP2不同，FP4纤维在35 mN/m的高压下依然保持完整，并整合在单层膜中。这表明FP4能够在紧密堆积的膜环境中保持其结构，其插入可能通过破坏脂质双分子层的连续性来促进融合孔的扩张。

表面压力对融合肽二级结构的影响

为了从分子构象层面理解上述组装行为的变化，研究人员利用激光直接红外光谱（LDIR）分析了肽段的二级结构。在20 mN/m下，FP2主要呈现β-折叠结构，这与其形成柔性螺旋纤维的观察一致；FP1则以α-螺旋为主，并伴有部分β-折叠和随机卷曲，这与其形成刚性纤维相符；FP4则显示出以随机卷曲为主的构象。当压力增加到35 mN/m时，FP1和FP2的β-折叠组分显著减少，而α-螺旋信号相对稳定，这与AFM观察到的纤维解组装现象相吻合。相比之下，FP4的二级结构谱图变化很小，这与其在高压下仍能维持纤维结构的结果一致。

FP1-2串联体：锚定与曲率的耦合

为了模拟FP1和FP2在天然刺突蛋白中的连续排列，研究人员构建了FP1-2串联肽。AFM成像显示，该串联肽在PM单层膜上形成了延展的螺旋状超分子组装体，其持久长度和弯曲刚度均高于单独的FP2。更重要的是，这些螺旋结构能够驱动局部的脂质重排，减少了其周围区域的液态有序相（Lo）含量，表明肽段能够诱导脂质相分离的破坏。当将FP1-2串联肽与DOPC:胆固醇小单层脂质体（SUV）孵育时，即使是在亚化学计量比的条件下，也能引发脂质体发生显著的聚集和融合，直径从80 nm迅速增加到200 nm。这有力地证明了FP1和FP2在功能上的协同作用，它们共同构成了一个能够驱动大规模膜重组的“最小融合模块”。

研究结论与讨论

该研究通过多尺度的生物物理表征，揭示了SARS-CoV-2融合肽在膜界面上的协同作用机制。FP1、FP2和FP4并非独立行动，而是形成了一个功能互补的整合系统。FP1通过形成刚性纤维，将病毒复合物锚定在宿主膜上；FP2则组装成柔性的螺旋纤维，作为弹性储库，在膜压缩时释放储存的机械能，从而驱动膜变形和融合；FP4则通过其强静电相互作用，在膜紧密堆积时插入并破坏脂质双分子层的连续性，促进融合孔的扩张。

这一“加载弹簧”机制为理解病毒入侵提供了全新的分子模型。它解释了即使病毒表面刺突蛋白数量有限，通过局部聚集，融合肽也能达到足够的密度，从而以协同的方式高效地完成膜融合。这一机制与细胞内的ESCRT-III蛋白利用螺旋结构重塑膜的策略有着惊人的相似性，揭示了生物系统在膜重塑过程中对机械能存储和释放的普遍利用。

除了在病毒学领域的重大意义，这项研究也为生物材料的设计提供了宝贵的启示。融合肽能够自组装成具有特定力学性质的纳米结构，并响应膜张力或压力，这为开发能够感知和响应环境变化的智能纳米材料，如药物递送载体或生物传感器，提供了新的设计原则。