四价抗体与FcγRIIB协同作用：增强抗CD27免疫治疗的新策略

《Nature Communications》：Harnessing multivalency and FcγRIIB engagement to augment anti-CD27 immunotherapy

尽管免疫检查点阻断疗法取得了显著进展，但其疗效仍受限于反应率差异、耐药性及毒性问题。本研究聚焦于共刺激受体CD27，通过构建四价抗体并选择性结合抑制性FcγRIIB，成功模拟了生理性膜锚定配体的作用模式。研究证实，该策略通过增强受体聚集、促进极化并减少内化，显著提升了T细胞活化和抗肿瘤疗效，为开发新一代激动性抗体疗法提供了新范式。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1抗体）虽然取得了革命性成功，但其疗效仍面临诸多挑战，包括反应率不均、耐药性以及免疫相关不良事件。因此，科学家们将目光投向了另一类策略——直接激活T细胞的共刺激信号通路，以期“踩下油门”而非“松开刹车”，从而更有效地激发抗肿瘤免疫反应。

其中，CD27作为肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）的重要成员，是T细胞活化的关键共刺激受体。其天然配体CD70在活化的T细胞和B细胞上表达，通过结合CD27传递强烈的增殖和存活信号。然而，将这一机制转化为有效的临床疗法却困难重重。例如，靶向CD27的临床抗体Varlilumab（一种人IgG1抗体）在临床试验中表现平平，疗效远低于预期。这背后可能的原因在于，传统的二价抗体难以有效模拟天然三聚体配体（CD70）诱导的受体聚集模式，而抗体Fc段与免疫细胞上Fcγ受体（FcγR）的相互作用也深刻影响着其生物学功能。

为了克服这些障碍，来自英国南安普顿大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项突破性研究。他们提出了一种全新的抗体工程策略，通过同时增加抗体对CD27的结合价数（从二价提升至四价）并优化其与抑制性FcγRIIB的结合，成功开发出具有强大激动活性的抗CD27抗体。该研究不仅揭示了多价性和FcγRIIB结合在驱动CD27信号转导中的协同作用机制，更在多种临床前肿瘤模型中证明了其卓越的抗肿瘤疗效，为开发新一代激动性免疫疗法提供了关键的理论依据和技术路径。

关键技术方法

本研究综合运用了多种生物化学、细胞生物学和动物模型技术。研究人员首先通过基因工程构建了四价抗小鼠CD27（mCD27）和抗人CD27（hCD27）抗体，并利用表面等离子共振（SPR）和流式细胞术验证了其结合亲和力与亲合力。在体外功能验证中，采用了表达NF-κB-GFP报告基因的Jurkat细胞系，评估抗体诱导的信号通路激活；同时利用小鼠脾脏来源的OT-I T细胞和人外周血单个核细胞（PBMCs）评估了T细胞增殖能力。在体内研究中，利用C57BL/6和Balb/c小鼠，构建了B16-OVA黑色素瘤、BCL1淋巴瘤和CT26结肠癌三种肿瘤模型，系统评估了抗体的抗肿瘤疗效、抗原特异性T细胞反应及安全性。此外，研究还通过共聚焦显微镜和电子显微镜技术，直观地观察了抗体诱导的CD27受体聚集、极化及内化过程。

研究结果

1. 四价抗mCD27抗体在体外表现出更强的亲合力和激动活性

为了评估增加价数对抗体功能的影响，研究人员首先构建了四价版本的抗mCD27抗体（AT124-1）。通过表面等离子共振（SPR）分析发现，四价抗体对mCD27的表观亲和力提高了5倍以上，这主要归因于其解离速率显著减慢。在流式细胞术分析中，四价抗体与表达mCD27的Jurkat细胞的结合亲合力也提高了约100倍。

在功能验证方面，研究人员发现，无论是二价还是四价抗mCD27抗体，在溶液中都无法直接激活表达mCD27的Jurkat NF-κB-GFP报告细胞。然而，当这些细胞与表达mFcyRII的CHO细胞共培养时，抗体便能够诱导强烈的NF-κB信号激活。值得注意的是，在低浓度（0.001-1 nM）下，四价抗体的激动活性远强于二价抗体。在亚优化肽段刺激条件下，四价抗mCD27同样能更有效地促进OT-I T细胞的增殖，且这一活性依赖于FcγR的介导。

2. 四价抗mCD27抗体在体内显著增强抗原特异性CD8⁺T细胞反应和抗肿瘤疗效

为了验证体外发现的体内相关性，研究人员首先在过继转移OT-I T细胞的模型中进行了评估。结果显示，与二价抗体相比，四价抗mCD27治疗能诱导更显著的CD8⁺T细胞扩增，且这种扩增效应在整个收缩期都得以维持。重要的是，Fc段失活（N297A突变）的四价抗体完全丧失了活性，证实了FcγR交联在体内是必不可少的。

在B16-OVA黑色素瘤模型中，四价抗mCD27同样诱导了最强的内源性OVA特异性CD8⁺T细胞反应，并实现了更有效的肿瘤控制。在BCL1淋巴瘤模型中，二价抗mCD27将小鼠的中位生存期从16天延长至39.5天，而四价抗体则进一步将中位生存期延长至71.5天，显示出更强的治疗潜力。

在CT26结肠癌模型中，研究人员观察到了一个有趣的现象：该肿瘤对免疫治疗表现出异质性反应，部分小鼠对治疗有反应，部分则无反应。在反应者中，二价抗mCD27的治愈率为50%，而四价抗mCD27则实现了100%的完全肿瘤消退。此外，四价抗体治疗并未引起小鼠体重下降或肝酶（ALT/AST）水平升高，表明其增强的抗肿瘤活性并未伴随毒性的增加。对肿瘤浸润淋巴细胞的进一步分析显示，四价抗mCD27治疗增加了肿瘤内总CD8⁺T细胞以及活化（4-1BB⁺和颗粒酶B⁺）CD8⁺T细胞的比例，但对CD4⁺T细胞或Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）没有影响，提示其作用机制主要是直接共刺激CD8⁺T细胞。

3. 四价性和FcγRIIB结合在抗hCD27抗体中同样发挥协同作用

为了评估该策略的临床转化潜力，研究人员将同样的方法应用于抗人CD27（hCD27）抗体hCD27.15。他们构建了二价和四价版本，并使用了三种不同的Fc骨架：野生型人IgG1、选择性增强FcγRIIB结合并降低FcγRI结合的V11变体，以及FcγR结合缺陷的NA变体。

在NF-κB报告基因实验中，四价抗hCD27抗体在无FcγRIIB存在的情况下，其激动活性比二价抗体强约1000倍。当存在FcγRIIB⁺CHO细胞时，四价抗体的活性优势依然显著（EC₅₀值低40-400倍）。在人PBMCs的T细胞增殖实验中，野生型人IgG1骨架的抗体（无论是二价还是四价）均表现出轻微的抑制效应，这可能是由于抗体与PBMCs上的激活型FcγR结合导致了T细胞清除。然而，使用V11变体（选择性结合FcγRIIB）时，四价抗hCD27抗体则表现出强大的共刺激活性，显著促进了T细胞增殖。而FcγR结合缺陷的NA变体则完全丧失了共刺激功能。这些结果表明，在人类系统中，四价性和FcγRIIB结合同样能够协同增强抗hCD27抗体的激动活性。

4. 四价性增强hCD27聚集，而FcγRIIB结合促进极化并减少内化

为了深入探究其作用机制，研究人员利用共聚焦显微镜观察了抗体对CD27受体分布的影响。他们发现，在无FcγR存在的情况下，四价抗hCD27抗体诱导的细胞膜上CD27-GFP聚集簇的数量显著多于二价抗体。当表达hCD27-GFP的Jurkat细胞与表达hFcγRIIB的CHO细胞共培养时，四价抗hCD27抗体诱导的CD27聚集簇被极化到细胞-细胞接触界面，并且这些聚集簇在细胞表面持续存在，内化过程被显著抑制。相比之下，在没有FcγRIIB的情况下形成的CD27聚集簇则随机分布，并在20-30分钟内迅速内化。

为了进一步验证FcγRIIB介导的极化作用的重要性，研究人员比较了使用二抗进行超交联和FcγRIIB结合两种方式对NF-κB信号激活的影响。结果显示，虽然二抗超交联能够增强四价抗体的激动活性，但FcγRIIB的参与能够诱导更强的信号激活，这突显了FcγRIIB介导的CD27极化在实现最佳激活中的关键作用。

结论与讨论

本研究通过巧妙的抗体工程，成功地将多价性和选择性FcγRIIB结合这两种策略结合起来，开发出了具有强大激动活性的抗CD27抗体。研究证实，四价抗体通过其更高的亲合力和更慢的解离速率，能够更有效地诱导CD27受体的聚集。而FcγRIIB的参与则进一步将受体聚集簇极化到细胞-细胞接触界面，并抑制了受体的内化，从而在细胞膜上形成更高浓度的活性受体，最终导致下游信号通路的强烈激活。

这项研究不仅为开发更有效的抗CD27疗法提供了明确的策略，也揭示了FcγRIIB在促进TNFRSF激动剂功能中的核心作用。研究结果提示，在开发激动性抗体时，应避免使用具有强效应功能的Fc骨架（如人IgG1），而应优先选择能够选择性结合FcγRIIB的变体，以避免不必要的T细胞清除和潜在毒性。

更重要的是，该研究提出的“多价性+FcγRIIB结合”策略具有高度的普适性。鉴于TNFRSF家族其他成员（如OX40、4-1BB等）的激动剂抗体在临床开发中也面临着类似的挑战，这一策略有望为整个激动性免疫治疗领域提供新的思路，推动下一代免疫激动剂的开发，为更多癌症患者带来希望。