利用ec3D重构染色体外DNA三维结构揭示其空间构象与致癌调控新机制

《Nature Communications》：Reconstructing the three-dimensional architecture of extrachromosomal DNA with ec3D

本研究开发了ec3D计算方法，通过Hi-C数据成功重构ecDNA的三维结构，发现其球形构象介导独特的长程调控互作，揭示了ecDNA通过空间拓扑重排突破染色体限制、促进癌基因高表达的新机制，为肿瘤靶向治疗提供新思路。

　　

在人类癌症中，染色体外DNA（ecDNA）作为环状DNA分子广泛存在，是驱动肿瘤进化与耐药性的关键因素。这些特殊的遗传元件不仅通过拷贝数扩增激活癌基因，更因其独特的环状拓扑结构颠覆了传统染色质的调控模式——它们打破拓扑关联结构域（TAD）边界，重编程增强子-启动子互作网络，形成促进肿瘤恶性进展的"调控中心"。然而，由于ecDNA尺寸巨大（通常达10⁶-10⁸bp）且存在复杂的结构变异，其三维空间构象长期以来如同"黑箱"，阻碍了人们深入理解其生物学功能。

近日，《Nature Communications》发表了一项突破性研究，由加州大学圣迭戈分校Biswanath Chowdhury、Kaiyuan Zhu、Chaohui Li等科学家领衔的团队开发出计算方法ec3D，首次实现了从Hi-C数据中高精度重构ecDNA的三维结构。这项研究通过算法创新解决了ecDNA中重复序列段落的折叠难题，并结合超分辨率显微成像验证，揭示了ecDNA的球形空间构象特征及其介导的特殊染色质互作模式。

研究团队整合全基因组测序（WGS）与Hi-C染色质构象捕获数据，建立了基于泊松似然最大化的三维重构模型。ec3D方法的核心突破在于能够处理ecDNA特有的重复序列：当基因组区域在ecDNA上存在多拷贝时，算法通过"扩展矩阵"策略区分各拷贝的空间位置，同时利用正则化项保证连续基因组区段的均匀空间分布。通过多维标度变换（MDS）初始化结构，结合迭代优化算法（L-BFGS）同步估计空间坐标与功率律衰减参数α（反映互作频率随空间距离的衰减规律）。此外，研究还设计了显著性互作识别流程，可检测由结构变异、空间邻近或跨分子互作引起的异常染色质接触。

在模拟数据验证中，ec3D展现出卓越的重构精度：与真实结构相比，重构结构的均方根偏差（RMSD）中位数仅为0.058（无重复序列）和0.102（含重复序列），显著优于MiniMDS、ShRec3D等现有方法。更重要的是，通过OligoSTORM超分辨率成像对TR14细胞系中MDM2癌基因ecDNA的直接观测，证实了ec3D预测的空间距离与实验测量高度相关（Pearson相关系数0.84）。

ec3D揭示ecDNA的球形空间构象特征

对9个癌细胞系的分析表明，所有ecDNA均折叠为闭合环状结构，与染色体上相同基因区的线性构象形成鲜明对比。例如在GBM39细胞系中，携带EGFR癌基因的ecDNA通过首尾连接形成环状，而正常细胞GM12878中同源区段则保持线性拓扑。通过最小体积包围盒分析发现，ecDNA的三维结构更接近扁球体而非扁平圆盘——其最小与最大轴长比值介于0.476-0.895之间。进一步通过限制空间重构的轴向范围实验证实，压缩任一维度都会导致泊松似然值显著下降（p≤0.0045），说明ecDNA需要充分利用三维空间实现最优折叠。

ecDNA与同源HSR结构的高度相似性

在等基因细胞系GBM39（含ecDNA）与GBM39HSR（含均质染色区HSR）的对比中，尽管扩增形式不同，但两者Hi-C互作图谱高度相似（相关系数0.9859）。ec3D重构显示它们的空间结构高度一致（RMSD=0.346），且均保留关键拓扑约束位点。这一发现支持了"ecDNA重新整合形成HSR"的假说，同时提示两种扩增形式可能共享相似的调控回路。

重复序列的空间折叠规律与跨样本保守性

针对含有重复片段的ecDNA（如D458、H2170细胞系），ec3D发现部分重复区域会折叠成相似的空间结构。例如H2170细胞中两个相距约3 Mb的重复片段（bin 18-96与364-442）呈现显著相似的三维构象（置换检验p=0.016）。尤为重要的是，在不同细胞系（CHP-212与IMR-5/75）中扩增的相同基因组区段（chr2:15.585-15.985 Mb）也展现出高度相似的空间折叠（RMSD=0.237，p=0.0072），表明DNA序列本身并非决定空间构象的唯一因素，表观调控因子与核内环境可能共同塑造其三维结构。

空间构象解析提升调控元件识别精度

在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系CHP-212中，ec3D重构的空间距离比传统Hi-C数据更精准地预测TAD边界：53.85%的边界与CTCF结合峰重合（Hi-C仅26.92%，p=4.5×10^-10）。三维结构显示，ecDNA上形成活性A区室（含LPIN1、TRIB2、DDX1和MYCN基因）与惰性B区室的空间分离，完美解释了为何6个癌基因中仅4个过度表达（p=1.0×10^-11）。特别值得注意的是，LPIN1基因在ecDNA断裂后，其5'端与MIR3681HG 3'端空间邻近，导致融合转录本表达，揭示了结构变异与三维构象协同调控基因表达的新机制。

细胞周期动态与潜在跨分子互作

通过分析MSTO211H细胞在G1期与M期的ecDNA结构，发现同一周期内 ensemble结构高度一致，而不同周期构象差异显著，表明ecDNA空间组织受细胞周期调控。此外，ec3D检测到一类"差异互作"——在循环基因组距离（circ-SI）分析中显著、但空间邻近性（spatial-SI）分析中不显著的互作，提示可能存在ecDNA分子间的trans互作。例如在RCMB56细胞中，chr1:86.905-86.935 Mb区域（含H3K27Ac标记的活性增强子）与多个远端癌基因区互作，可能是ecDNA枢纽（hub）中跨分子调控的表现。

该研究通过ec3D这一创新工具，首次系统揭示ecDNA的三维空间构象规律，证明其通过球形折叠突破染色体拓扑约束，实现增强子劫持与调控回路重编程。不仅为理解ecDNA的致癌机制提供新视角，更为靶向ecDNA空间结构的抗癌策略奠定基础。随着长读长测序与单细胞Hi-C技术的发展，ec3D有望在肿瘤异质性分析、动态构象监测等领域发挥更大价值。