EGFR激酶结构域二聚化在受体激活中的动态作用与变构调控机制

《Structure》：The role of kinase domain dimerization in EGFR activation

为阐明EGFR激活中胞内与胞外模块二聚化的相对贡献，研究人员通过冷冻电镜、SAXS和HDX-MS等技术，发现EGFR胞内激酶结构域（TKD）仅形成弱且瞬态的不对称二聚体（KD>100 μM），其 dimerization 可使激酶活性增强500倍以上，而致癌突变仅提升15-30倍。该研究揭示胞外二聚化主导EGFR活化，胞内TKD的柔性二聚界面可能为偏置信号转导提供调控基础。

　　

表皮生长因子受体（EGFR）作为受体酪氨酸激酶（RTK）家族的“原型”成员，其激活机制却十分特殊。不同于大多数RTK通过激活环（activation loop）磷酸化来激活激酶，EGFR的激活依赖于其激酶结构域（TKD）形成一种特定的不对称二聚体。在这一模型中，一个TKD作为“激活子”（activator），以其C端叶（C-lobe）与另一个作为“接收子”（receiver）的TKD的N端叶（N-lobe）相互作用，从而变构激活接收子的激酶活性。这一不对称二聚体界面在晶体结构中已被解析，然而，在完整EGFR的冷冻电镜（cryo-EM）结构中，胞内区域却始终模糊不清，提示其可能具有高度的动态性。这一矛盾引出了一个核心问题：在配体激活的完整EGFR中，究竟是胞外区域的强二聚化，还是胞内激酶结构域的相互作用，在驱动受体二聚化和激活中占主导地位？此外，与其它RTK相比，文献报道的EGFR激酶活性（k_cat值通常在1 s^-1以下）异常低，这与其需要快速完成多个自磷酸化事件的任务似乎不相称。这些谜团促使Petrova等人对EGFR激酶结构域二聚化的强度、稳定性和功能后果进行了深入探究。

为了回答上述问题，研究人员综合运用了生物化学、生物物理学和结构生物学等多种关键技术。研究的关键模型包括一种在肺癌中发现的激酶结构域重复（Kinase Domain Duplication, KDD）的EGFR变异体（其胞内区含有两个串联的TKD）以及工程化的离散不对称二聚体系统。主要技术手段包括：冷冻电镜（cryo-EM）用于解析KDD蛋白的结构；小角X射线散射（SAXS）和沉降平衡分析超速离心（SE-AUC）用于分析溶液中的蛋白质构象和相互作用强度；氢氘交换质谱（HDX-MS）用于探测蛋白质界面的动态性；以及基于荧光肽底物的激酶活性测定用于量化二聚化对催化效率的增强效应。

Cryo-EM structure of an epidermal growth factor receptor kinase domain dimer

研究人员首先利用冷冻电镜研究EGFR-KDD变异体的胞内区（KDD^ICRΔC）的结构。初始的冷冻电镜数据显示KDD^ICRΔC具有高度的异质性和灵活性，大部分颗粒无法解析出高分辨率结构。在添加了能稳定TKD活性构象的小分子化合物2后，成功解析了KDD^ICRΔC中两个TKD形成的不对称二聚体结构，分辨率达3.27 ?。

该结构显示，C端的TKD（TKD2，接收子）呈现出活性样的构象，而N端的TKD（TKD1，激活子）则更倾向于非活性构象。然而，连接两个TKD的连接子（linker）区域在图中没有清晰的密度，表明其具有柔性。这一结果提示，即使在共价连接的情况下，两个TKD之间的不对称二聚体界面也是相对脆弱和动态的。

The epidermal growth factor receptor tyrosine kinase domains dimer in KDDICRAC is highly flexible

为了在溶液中进行验证，研究人员利用SAXS分析了KDD^ICRΔC的构象。SAXS数据显示，KDD^ICRΔC的旋转半径（R_g）和最大尺寸（D_max）均显著大于根据晶体结构中的不对称二聚体计算出的理论值。

无维度Kratky图表明KDD^ICRΔC并非未折叠蛋白，但其展宽的峰提示它是一个具有柔性连接子的多结构域蛋白。进一步的三维形状重建（DAMMIN模型）显示KDD^ICRΔC的分子包络比晶体结构中的二聚体更为伸展。这些结果共同证实了KDD^ICRΔC中的两个TKD并非牢固地“锁定”在不对称二聚体界面中，而是在溶液中动态地探索多种相对位置。

The asymmetric kinase domain interface is highly dynamic

为了直接探测不对称二聚体界面的结合程度，研究人员采用了HDX-MS技术。结果显示，KDD^ICRΔC连接子中独特的肽段交换非常迅速，表明该区域高度柔性且溶剂可及。虽然在与不对称二聚体界面相关的某些肽段（如激活子C端叶的αG-αH和αI-αJ区域）观察到了微弱的保护效应，但差异在统计上并不显著。这进一步支持了不对称二聚体界面在KDD^ICRΔC中是弱结合且动态的。

Discrete dimers of the epidermal growth factor receptor intracellular module are unexpectedly weak

接下来，研究人员直接测量了包含完整近膜区（JM）的EGFR胞内模块（JM-TKD）形成离散不对称二聚体的亲和力。他们采用了一种基于点突变（TKD^I706Q和 JM-TKD^V948R）的互补策略，以阻止形成“菊花链”式寡聚体，从而专门研究离散二聚体。SE-AUC分析显示，即使在28 μM的高浓度下，也检测不到TKD^I706Q和 JM-TKD^V948R之间的二聚化，表明其解离常数（K_D）大于100 μM。这比配体结合的EGFR胞外区二聚体的K_D（1-3 μM）要弱两个数量级以上，说明在完整的野生型EGFR中，胞外区域的相互作用是驱动二聚化的主要力量。

Stabilizing the active-like conformation promotes JM-tyrosine kinase domain dimerization

有趣的是，当加入稳定TKD活性构象的化合物2后，TKD^I706Q和 JM-TKD^V948R之间形成了可检测的离散二聚体，通过全局拟合SE-AUC数据得出其K_D为26.7 ± 8.3 μM。加入拉帕替尼（lapatinib，一种稳定TKD非活性构象的抑制剂）可逆转此效应，而厄洛替尼（erlotinib）则无此作用。这表明，只有当TKD被稳定在活性样构象时，胞内模块才能发生较明显的二聚化，但其强度仍远弱于胞外模块。

Tyrosine kinase domain dimerization is much more activating than oncogenic mutations

最令人惊讶的发现来自于二聚化对激酶活性的影响。研究人员设计了一种通过二硫键交联的“S-S二聚体”，来模拟稳定的不对称二聚体。该S-S二聚体的k_cat值高达22.5 ± 14 s^-1，与野生型单体TKD（k_cat~ 0.042 s^-1）相比，活性增强了约540倍。这一激活程度远远超过致癌突变（如L858R）对单体TKD的激活（仅15-30倍）。更重要的是，柔性更强的KDD^ICRΔC蛋白也表现出与S-S二聚体相似的超高活性（k_cat= 22.7 ± 4.5 s^-1）。即使在KDD^ICRΔC的接收子TKD中引入L858R突变，其k_cat也仅再提高约1.8倍（至41.8 ± 1 s^-1）。这些数据 unequivocally 表明，TKD的二聚化本身是激活EGFR激酶的一个极其强大的机制，其效果远超单个致癌突变。

The flexible KDD dimer has a similar kcat to the S-S dimer

尽管S-S二聚体和KDD^ICRΔC在刚性程度上不同（前者共价交联，后者柔性连接），但二者却表现出几乎相同的k_cat值。研究人员推测，在S-S二聚体中，引入的二硫键可能对二聚体界面造成了轻微的构象扭曲，这从其升高的K_{M, ATP}值（82 ± 9 μM vs 野生型单体的12 μM）中可见端倪。而在KDD^ICRΔC中，较弱的TKD关联可能也导致界面并非处于最优状态。这两种情况下的折衷效应可能使得它们的活性最终收敛到一个相似的水平。

Epidermal growth factor receptor/ErbB3 asymmetric heterodimers are also weak

研究人员还将研究扩展至EGFR与ErbB3形成的胞内异源二聚体。SE-AUC分析表明，EGFR JM-TKD^V948R（作为接收子）与ErbB3 TKD（作为激活子）之间的相互作用同样非常弱（K_D>100 μM）。在添加化合物2后，可以检测到异源二聚体的形成，其K_D为12.7 ± 5.8 μM，与同源二聚体的强度无显著差异。这表明，对于EGFR/ErbB3异源二聚体而言，TKD间的相互作用也并非驱动二聚化的主要因素。

本研究通过多方面的证据得出几个重要结论。首先，在完整的EGFR中，配体诱导的胞外区域二聚化是驱动受体二聚化的主导因素，而胞内激酶结构域之间的相互作用非常弱（K_D>100 μM）且是瞬态的。这合理解释了为何在完整EGFR的冷冻电镜结构中胞内区域难以解析——因为它们处于高度动态的状态。其次，尽管结合微弱，但一旦两个TKD在胞外二聚体的框架下被拉到一起并形成（即使是瞬态的）不对称二聚体，就能极大地激活激酶活性（增强超过500倍），使其k_cat值提升到与其他高活性RTK相当的水平（~20 s^-1）。这表明之前报道的EGFR低活性可能反映的是其单体或二聚化不完全的状态。第三，致癌突变的主要作用可能并非直接大幅提升单体TKD的活性，而是通过促进受体二聚化（包括胞外和胞内）来间接实现激活。最后，这种弱且瞬态的胞内TKD二聚化特性，可能为EGFR的“偏置信号”（biased signaling）提供了结构基础。不同的配体可能诱导强度不同的胞外二聚体，从而调控胞内TKD二聚化的寿命和频率，最终影响下游信号通路的动力学和细胞命运决策。这项发表于《Structure》的研究深化了对EGFR激活分子机制的理解，特别是明确了胞内和胞外模块在二聚化中的相对贡献，并对致癌突变的作用机制和受体信号的特异性调控提出了新的见解。