N-聚糖构象熵调控Fcγ受体IIIa/CD16a结合亲和力的结构机制解析

《Structure》：The impact of N-glycan conformational entropy on the binding affinity of Fc γ receptor IIIa/CD16a

本研究针对Fcγ受体IIIa (FcγRIIIa/CD16a) 结合亲和力调控机制不清的问题，通过解析FcγRIIIa (F158) 与IgG1 Fc及3G8 Fab的复合物晶体结构，结合分子动力学模拟，揭示了N162位点N-聚糖的构象熵是调控IgG1 Fc结合亲和力的关键驱动力，为基于FcγRIIIa的抗体药物设计提供了新视角。

　　

在抗体药物研发的广阔天地中，Fcγ受体IIIa (FcγRIIIa/CD16a) 扮演着至关重要的角色。它主要表达于自然杀伤细胞 (NK细胞) 和巨噬细胞表面，是连接抗体与免疫细胞的关键桥梁。当抗体通过其Fc段与FcγRIIIa结合后，便能激活这些免疫细胞，执行抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 和抗体依赖性细胞吞噬 (ADCP) 等效应功能，从而清除病原体或肿瘤细胞。因此，抗体与FcγRIIIa的结合亲和力直接决定了抗体药物的疗效。

然而，FcγRIIIa的结合亲和力并非一成不变，它受到多种因素的精细调控。其中，一个长期悬而未决的谜题是：FcγRIIIa上第162位天冬酰胺 (N162) 连接的N-聚糖的组成，是如何影响其与抗体Fc段的结合亲和力的？已知的是，较短的寡甘露糖型 (Oligomannose-type) 或截短的N-聚糖能显著增强结合亲和力，而较长的复杂型 (Complex-type) N-聚糖则会削弱亲和力。尽管这一现象已被观察到，但其背后的分子机制，特别是N-聚糖的构象熵 (Conformational Entropy) 在其中扮演的角色，却一直缺乏清晰的结构和能量学证据。

为了解开这个谜团，由Paul G. Kremer和Adam W. Barb领衔的研究团队在《Structure》杂志上发表了一项重要研究。他们通过解析FcγRIIIa与两种竞争性配体——IgG1 Fc和3G8 Fab的复合物晶体结构，并结合创新的计算模拟方法，首次量化了N162 N-聚糖的构象熵对结合亲和力的贡献，揭示了其作为调控FcγRIIIa亲和力的主要驱动力。

为了深入探究FcγRIIIa与不同配体结合的分子细节，研究团队采用了多种前沿的生物物理和计算生物学技术。他们首先通过表面等离子共振 (SPR) 技术精确测定了3G8 Fab和IgG1 Fc与不同FcγRIIIa亚型 (F158和V158) 及不同糖型 (Complex-type和Man5) 的结合亲和力。随后，利用X射线晶体学技术，成功解析了FcγRIIIa (F158) 分别与IgG1 Fc和3G8 Fab形成的复合物的高分辨率晶体结构 (PDB ID: 7URU和9PRU)。为了量化N-聚糖的构象熵，研究人员开发了一种基于GLYCAM Molecular Modeling Library 2 (GMML2) 的计算方法，通过随机生成大量符合实验约束的N-聚糖构象，并评估其在配体结合后构象空间的限制程度，从而计算出熵变 (ΔS°) 对结合自由能 (ΔG°) 的贡献。

3G8 Fab与IgG1 Fc以不同模式竞争结合FcγRIIIa

研究人员首先通过SPR实验证实，3G8 Fab与FcγRIIIa的结合亲和力远高于IgG1 Fc，且对FcγRIIIa的N162糖型变化不敏感，这与IgG1 Fc的结合行为形成鲜明对比。为了从结构上解释这一差异，他们解析了FcγRIIIa (F158) 与3G8 Fab的复合物晶体结构 (分辨率1.90 ?)。结构显示，3G8 Fab主要结合在FcγRIIIa胞外区的第二个结构域，其结合表位与IgG1 Fc的表位存在显著重叠，这解释了二者竞争结合的现象。然而，二者的结合模式存在根本差异：3G8 Fab的结合角度几乎垂直于细胞膜平面，其结合界面主要围绕FcγRIIIa的K161、W90和W113等关键残基，且不直接接触N162 N-聚糖。相比之下，IgG1 Fc的结合模式则会将N162 N-聚糖限制在一个狭窄的空隙中，从而限制了其构象自由度。

FcγRIIIa (F158) 与IgG1 Fc复合物结构揭示亲和力差异的分子基础

为了更全面地理解FcγRIIIa的亲和力调控，研究人员还解析了亲和力较低的F158亚型与IgG1 Fc的复合物晶体结构 (分辨率2.4 ?)。通过与已报道的V158亚型结构比较，他们发现F158侧链的增大导致其与W90残基的堆积方式发生改变，进而引起W90向外移动。这一微小的构象变化最终导致FcγRIIIa与IgG1 Fc的结合界面发生调整，特别是减少了N162 N-聚糖与Fc N297 N-聚糖之间的相互作用，这可能是F158亚型亲和力较低的结构原因之一。

N162 N-聚糖构象熵是调控IgG1 Fc结合亲和力的主要驱动力

为了量化N-聚糖构象熵的贡献，研究人员开发了一种计算模型。他们通过随机生成大量N162 N-聚糖的构象，并评估这些构象在配体结合后是否会发生空间碰撞。计算结果显示，当IgG1 Fc结合时，N162 N-聚糖的构象空间会受到严重限制，导致一个显著的熵罚 (Entropic Penalty)，其大小与N-聚糖的长度和复杂性呈正相关。例如，对于携带A2G2S1 (一种复杂的唾液酸化双天线N-聚糖) 的FcγRIIIa，其与IgG1 Fc结合时，N162 N-聚糖的构象熵罚高达2.1 kcal/mol。这一数值与之前实验测得的结合自由能变化 (1.7-2.2 kcal/mol) 高度吻合。更重要的是，计算得到的熵罚与实验测得的结合亲和力 (K_D) 之间存在显著的线性相关 (R²= 0.88)，有力地证明了N162 N-聚糖的构象熵是调控IgG1 Fc结合亲和力的主要因素。相比之下，3G8 Fab的结合仅造成极小的熵罚 (约0.3 kcal/mol)，这解释了为何3G8 Fab的结合亲和力不受N162糖型变化的影响。

这项研究通过高分辨率的晶体结构和创新的计算模拟，首次将FcγRIIIa N162 N-聚糖的构象熵与配体结合亲和力直接联系起来，并对其进行了量化。研究结果表明，N162 N-聚糖的构象熵是调控IgG1 Fc结合亲和力的主要驱动力，而3G8 Fab通过其独特的结合模式巧妙地避开了这一熵罚，从而维持了高亲和力。这一发现不仅解决了长期困扰该领域的科学问题，也为基于FcγRIIIa的抗体药物设计提供了新的思路。例如，在设计能够有效结合F158亚型 (该亚型在人群中更常见，但亲和力较低) 的抗体时，可以考虑采用类似3G8 Fab的结合模式，以最小化N-聚糖构象熵带来的不利影响，从而开发出更有效的免疫治疗药物。