灰葡萄孢效应蛋白BcCrh1来源的双表位时空表达激活植物多层免疫机制研究

《Molecular Plant》：Activation of multilayered plant immunity through spatiotemporal expression of Botrytis cinerea BcCrh1-derived dual epitopes

本研究针对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）防治难题，通过解析其细胞死亡诱导蛋白Bcrh1的免疫活性表位，开发了基于胞外表位（EE）和胞内表位（IEM）的双表位免疫激活策略。研究人员利用病原诱导型启动子实现表位的时空特异性表达，在拟南芥和番茄中成功激活水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）通路协同的免疫反应，显著增强对灰葡萄孢和丁香假单胞菌的抗性，同时规避了组成型表达导致的生长缺陷。该研究为作物抗病育种提供了创新性的表位免疫工程策略。

　　

在农业生产中，灰葡萄孢（Botrytis cinerea）作为一种典型的死体营养型病原真菌，每年给全球农作物造成巨大的经济损失。这种病原菌能够侵染200多种作物，引发灰霉病，导致果实腐烂和品质下降。目前主要依赖化学杀菌剂进行防治，但长期使用不仅导致病原菌产生抗药性，还带来环境污染和食品安全问题。因此，开发新型、可持续的病害控制策略迫在眉睫。

植物自身拥有一套精密的免疫系统，能够通过识别病原菌相关的分子模式（PAMP）来激活防御反应。其中，病原菌分泌的细胞死亡诱导蛋白（CDIP）既能促进病害发展，又能被植物识别从而触发免疫反应，这为开发新型免疫诱导剂提供了思路。然而，如何平衡免疫激活与植物正常生长发育之间的关系，即克服"生长-防御权衡"难题，一直是该领域面临的重大挑战。

在这项发表于《Molecular Plant》的研究中，Yong Liang、Kai Bi等研究人员深入解析了灰葡萄孢效应蛋白BcCrh1的免疫机制，并开发了一种创新的双表位免疫激活策略。研究人员发现BcCrh1蛋白中存在的两个独立免疫表位——胞外表位（EE）和胞内表位（IE），通过基因工程技术成功分离了其细胞死亡诱导活性和免疫激活功能，获得了仅保留免疫活性的突变胞内表位（IEM）。更重要的是，他们利用2A自剪切肽系统构建了EE-IEM融合表达载体，实现了两个表位在植物细胞不同区室（apoplast和cytoplasm）的协同表达。

研究采用的主要技术方法包括：农杆菌介导的植物瞬时表达和稳定转化技术、激光共聚焦显微镜进行蛋白亚细胞定位分析、转录组测序（RNA-seq）和代谢组学分析、病原菌接种实验，以及β-雌二醇（E2）诱导的XVE表达系统。实验材料涉及拟南芥（Arabidopsis thaliana）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）和番茄（Solanum lycopersicum）等多种植物体系。

分离植物细胞死亡和防御激活的BcCrh1来源表位

研究人员通过对BcCrh1来源的35个氨基酸肽段（BcCrh1^93-127）进行系统性的缺失突变和位点定向突变，成功鉴定出三个关键氨基酸（E114、D117、L118）负责细胞死亡诱导活性。突变这些位点后获得的IEM肽段完全丧失了细胞死亡诱导能力，但保留了免疫激活功能。同时，研究人员还鉴定了一个位于蛋白质胞外区域的免疫表位EE（BcCrh1^75-144），该表位同样能够激活植物免疫反应而不引起细胞死亡。

IEM和EE肽段诱导局部和系统抗性

瞬时表达实验表明，IEM和EE均能显著诱导活性氧（ROS）积累和胼胝质沉积，且两个表位的共表达产生协同增强效应。接种实验证实，这两个表位不仅能激活局部抗性，还能诱导系统获得性抗性（SAR），显著降低灰葡萄孢的侵染程度。基因表达分析进一步验证了SAR标记基因在系统叶片中的上调表达。

转基因拟南芥株系表达IEM和EE肽段显示增强的抗性

研究人员成功获得了组成型表达EE、IEM和EE-IEM的转基因拟南芥株系。病原菌接种实验显示，所有转基因株系对灰葡萄孢和丁香假单胞菌（Pst DC3000）均表现出增强的抗性，其中EE-IEM共表达株系的抗性最强。激素通路基因表达分析发现，EE主要激活水杨酸（SA）通路基因，而IEM更倾向于激活茉莉酸（JA）通路基因，EE-IEM则能协同激活两条通路。

病原诱导型表达EE-IEM恢复正常植物生长同时保持抗性

为解决组成型表达导致的生长缺陷问题，研究人员选取了灰葡萄孢诱导型启动子BIK1和PLA2A来驱动EE-IEM的表达。结果表明，病原诱导型表达株系在保持良好抗性的同时，完全避免了组成型表达引起的生长阻滞现象。启动子活性分析显示，BIK1启动子特异响应灰葡萄孢侵染，而PLA2A启动子对灰葡萄孢和丁香假单胞菌均有响应。

IEM、EE和EE-IEM肽段激活互补的防御通路

转录组分析揭示，IEM主要激活植物激素信号转导通路，特别是JA、乙烯、生长素和细胞分裂素相关通路，同时调控MAPK信号级联。EE则显著富集苯丙烷生物合成通路，促进水杨酸生物合成和木质素积累。而EE-IEM共表达不仅同时激活了上述通路，还独特上调了谷胱甘肽抗氧化系统，表明其能够诱导更为复杂的免疫状态。

通过EE-IEM表位免疫激活工程化广谱抗性番茄

研究人员进一步在番茄中验证了这一策略的实用性。在BIK1和PLA2A启动子驱动下，EE-IEM转基因番茄植株表现出正常的生长发育和产量，同时对灰葡萄孢和丁香假单胞菌均表现出显著增强的抗性。值得注意的是，这种抗性在模拟自然接种条件下尤为明显，病害发展被限制在微坏死阶段。

该研究成功开发了一种基于病原效应蛋白双表位的免疫激活策略，通过时空特异性的表达方式，实现了植物免疫系统的精准调控。这种策略不仅有效规避了传统免疫工程中的生长-防御权衡问题，还为作物抗病育种提供了新的技术路线。特别值得关注的是，该研究首次展示了胞外和胞内免疫表位的协同效应，为理解植物多层免疫系统的运作机制提供了新的视角。未来，通过优化表达调控元件和结合其他抗病策略，这一方法有望在多种作物中实现广泛应用，为可持续农业发展提供重要技术支持。