白藜芦醇通过上调Cx43及诱导ROS依赖性凋亡与顺铂协同抑制骨肉瘤U2-OS细胞

《Hormones & Cancer》：Resveratrol synergizes with cisplatin to suppress osteosarcoma U2-OS cells via up-regulating Cx43 and inducing ROS-dependent apoptosis

为解决顺铂(CDDP)治疗骨肉瘤(OS)时存在的毒副作用及耐药性问题，研究人员开展了白藜芦醇(Res)联合CDDP治疗OS的研究。结果表明，Res与CDDP具有协同抗肿瘤作用，其机制涉及上调Cx43、抑制Wnt/β-catenin通路及诱导ROS依赖性凋亡。该研究为OS的联合治疗提供了新的策略和理论依据。

　　

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，其治疗一直是临床上的巨大挑战。尽管手术联合化疗（如顺铂）是标准疗法，但顺铂的严重毒副作用和肿瘤细胞产生的耐药性，常常导致治疗失败或患者无法耐受，使得晚期或复发患者的5年生存率极低。因此，寻找能够增强顺铂疗效、降低其毒性的辅助药物，成为改善骨肉瘤预后的关键。

白藜芦醇(Resveratrol, Res)是一种广泛存在于葡萄皮、虎杖等植物中的天然多酚类化合物。它以其低毒性和多靶点特性而闻名，不仅具有抗氧化、抗炎等作用，更被证实对多种癌症具有抑制作用。更重要的是，已有研究表明，白藜芦醇能够与多种化疗药物产生协同效应，增强其抗肿瘤活性。然而，白藜芦醇与顺铂联合治疗骨肉瘤的具体效果及其背后的分子机制，尚不明确。

为了回答这一问题，来自安徽理工大学第一临床医学院和深圳大学第三附属医院（罗湖医院）的研究团队在《Discover Oncology》杂志上发表了一项研究。他们发现，白藜芦醇能够显著增强顺铂对骨肉瘤U2-OS细胞的杀伤作用，这种协同效应是通过上调连接蛋白43(Cx43)的表达，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，并诱导活性氧(ROS)依赖性细胞凋亡来实现的。这一发现为骨肉瘤的联合治疗策略提供了新的理论依据和潜在靶点。

主要技术方法

本研究主要利用人骨肉瘤U2-OS细胞系进行体外实验。通过慢病毒转染技术构建了Cx43稳定敲低(shCx43)的细胞模型。采用CCK-8法检测细胞增殖，克隆形成实验评估长期增殖能力，流式细胞术分析细胞凋亡，DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(ROS)水平，划痕实验和Transwell实验分别评估细胞迁移和侵袭能力，并通过qRT-PCR和Western blotting技术检测相关基因和蛋白的表达水平。

研究结果

1. 白藜芦醇与顺铂对骨肉瘤细胞具有协同杀伤作用

研究人员首先评估了白藜芦醇(Res)和顺铂(CDDP)单独或联合使用对骨肉瘤U2-OS细胞增殖的影响。结果显示，与单独用药相比，Res与CDDP联合处理能更显著地抑制细胞活力。通过Chou-Talalay方程计算联合指数(CI)，所有联合浓度的CI值均小于1，证实了两种药物之间存在显著的协同作用。此外，在长期克隆形成实验中，联合治疗组形成的细胞集落数量也远少于单药组，进一步证明了该组合对骨肉瘤细胞增殖的持续协同抑制作用。

2. 联合治疗通过诱导ROS依赖性凋亡增强细胞毒性

为了探究联合治疗增强细胞毒性的机制，研究人员检测了细胞凋亡情况。流式细胞术和DAPI染色结果显示，Res+CDDP联合处理组的细胞凋亡率显著高于单药组。同时，联合治疗组细胞内活性氧(ROS)水平也明显升高，且呈时间依赖性。当使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除ROS后，联合治疗诱导的细胞毒性被显著逆转，细胞凋亡率也相应降低。在分子水平上，联合治疗下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调了促凋亡蛋白Bax的表达，而NAC预处理则能逆转这些变化。这些结果表明，Res与CDDP的协同杀伤作用是通过诱导ROS依赖性细胞凋亡来实现的。

3. 联合治疗协同抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

肿瘤的转移是导致骨肉瘤患者死亡的主要原因。划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示，Res+CDDP联合处理对U2-OS细胞的迁移和侵袭能力具有最强的抑制作用。机制研究发现，联合治疗显著上调了上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，同时下调了基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。这些分子的变化共同作用，抑制了肿瘤细胞的侵袭转移能力。

4. Cx43上调是联合治疗发挥协同效应的关键

连接蛋白43(Cx43)是细胞间通讯的关键蛋白，在多种肿瘤中发挥抑癌作用。研究人员发现，Res+CDDP联合处理能显著上调U2-OS细胞中Cx43的mRNA和蛋白表达水平。为了验证Cx43在协同效应中的关键作用，他们构建了Cx43稳定敲低的细胞模型。结果显示，敲低Cx43后，联合治疗对细胞增殖、克隆形成、凋亡、迁移和侵袭的抑制作用均被显著削弱。这表明，Cx43的上调是Res与CDDP发挥协同抗肿瘤活性的必要条件。

5. 联合治疗通过Cx43抑制Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路的异常激活是骨肉瘤发生发展的重要驱动因素。研究发现，Res+CDDP联合处理能显著下调Wnt/β-catenin通路的关键分子，包括β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达。更重要的是，当敲低Cx43后，联合治疗对Wnt/β-catenin通路的抑制作用被逆转，这些分子的表达水平得以恢复。这揭示了Cx43在联合治疗抑制Wnt/β-catenin通路中的关键桥梁作用。

结论与讨论

本研究首次揭示了白藜芦醇(Res)与顺铂(CDDP)在骨肉瘤治疗中的协同作用及其分子机制。研究证实，Res通过上调连接蛋白43(Cx43)的表达，一方面抑制了促癌的Wnt/β-catenin信号通路，另一方面增强了肿瘤细胞对顺铂的敏感性。同时，联合治疗诱导了更高水平的活性氧(ROS)，从而触发了ROS依赖性细胞凋亡。这一“ROS-Cx43-β-catenin”调控轴的发现，为理解Res与CDDP的协同作用提供了全新的视角。

该研究不仅为骨肉瘤的联合治疗提供了新的策略，更重要的是，它强调了Cx43作为一个关键的抑癌蛋白，在增强化疗敏感性中的核心地位。通过靶向Cx43来调节肿瘤细胞的信号通路和氧化应激状态，有望成为克服顺铂耐药性的新途径。尽管本研究目前仅限于体外细胞实验，但其结果为后续的动物实验和临床转化研究奠定了坚实的理论基础，为改善骨肉瘤患者的预后带来了新的希望。