超越FoxP3：识别一种鸡源调节性T细胞的特征

《European Journal of Immunology》：Beyond FoxP3—Identification of a Chicken Regulatory T Cell Signature

鸡调节性T细胞（Treg）表面标志物及单细胞转录组分析

　　
本研究旨在系统解析鸡调节性T细胞（Tregs）的表型特征及鉴定标记，为后续功能研究奠定基础。作为重要的免疫调节细胞，哺乳动物Tregs通过CD4+、CD25+、FoxP3+等标志性特征进行识别，但其在禽类中的异质性尚未完全阐明。研究团队通过整合转录组测序、单细胞测序及流式细胞术技术，首次建立了鸡Tregs的多标记鉴定体系。

**研究背景与核心问题**
禽类免疫调节机制与哺乳动物存在显著差异。尽管鸡的FoxP3同源基因已确认存在，但缺乏特异性抗体使其难以直接检测。此外，传统以CD25为标志的鉴定方法在鸡中并不适用，如CD25+亚群中既包含Tregs也混杂其他功能亚群。研究团队通过创新性结合转录组学与表型分析，旨在解决以下科学问题：1）鸡Tregs的转录特征与表面标记组合；2）如何克服FoxP3检测的技术瓶颈；3）揭示禽类Tregs的进化保守性与物种特异性特征。

**关键技术路线与创新点**
研究采用三级技术验证体系：首先通过 bulk RNA-seq分析CD4+ T细胞亚群（CD25?/low/high）的转录特征，筛选出高表达FoxP3及相关调控基因的亚群；继而利用单细胞测序（scRNA-seq）解析20,838个单细胞的转录谱，建立基于转录特征的三维聚类模型；最终通过开发鸡特异性抗CTLA-4内吞抗体，结合GITR表达水平，构建四重标记（CD4+、CD25+、CTLA-4+、GITR+）的标准化鉴定流程。

**关键发现与机制解析**
1. **FoxP3表达的跨物种保守性**
通过RT-qPCR验证，鸡的FoxP3在CD25+亚群中呈现显著高表达（较CD25?亚群升高6.5倍，p=5.41E-101），证实其作为Tregs的分子标记的保守性。但与哺乳动物不同，CD25在鸡中无法单独区分Tregs与其他辅助性T细胞亚群。

2. **表面标记组合的突破性进展**
研究首次建立鸡特异性抗CTLA-4内吞抗体（AV92/AV94），发现：
- 仅有CD25+亚群中约0.2%-1.5%的细胞同时表达内吞型CTLA-4和GITR蛋白
- 该组合标记的CD4+CD25+GITR+CTLA-4+亚群中，FoxP3 RNA水平较对照组高2500-5100倍
- 创新性采用“内吞-表面”双标记策略，解决了哺乳动物中CTLA-4表面表达与内吞的差异问题

3. **单细胞转录组学的突破性发现**
通过scRNA-seq构建了23个功能亚群，其中两个核心Treg集群（9号集群占4.1%，15号集群占3.0%）呈现以下特征：
- **免疫抑制基因共表达**：均显著高表达CTLA4（抑制性受体）、PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）等经典Treg标记
- **功能分化**：集群9富含TGF-β（促Treg生成）和CCR6（趋化因子受体），可能参与组织修复；集群15高表达IL2RA（CD25），提示更强的IL-2竞争能力
- **跨物种比较**：与哺乳动物相比，鸡Tregs的IL-10分泌基因未显著激活，但IL33R（IL-33受体）表达水平提升40倍，暗示不同的免疫调控机制

4. **技术瓶颈的突破性解决方案**
针对鸡FoxP3抗体缺乏的难题，研究团队：
- 开发新型内吞型CTLA-4抗体（AV92/AV94），特异性识别鸡源CTLA-4的胞内定位特征
- 建立“转录-蛋白”双验证体系：既通过FOXP3 RNA表达量（2倍于CD25?亚群）辅助判断，又通过Gitr蛋白表达（CD25+亚群中仅0.1%-1.5%阳性）精准筛选
- 揭示鸡Tregs的独特的内吞标记模式：约80%的CD25+ T细胞在激活后呈现内吞型CTLA-4，而哺乳动物Tregs通常保留表面表达

**进化与功能启示**
研究证实禽类Tregs在分子机制上保持进化保守性：
- **FoxP3调控网络**：鸡Tregs与哺乳动物共享FOXP3下游调控模块，包括FOXP3→CD25→IL-2竞争的三重机制
- **免疫抑制途径差异**：鸡Tregs更依赖TGF-β（较哺乳动物高15倍表达）和CCR6（趋化到肠道等黏膜组织），而IL-10依赖性较低
- **病毒感染关联性**：MDV（马立克氏病毒）感染模型显示，CD25+/FoxP3+细胞在病毒清除中起关键作用，其特异性表达基因（如CCR6、TGF-β）在攻毒实验中显著上调

**方法论创新**
研究提出“三维表型鉴定模型”：
1. **空间维度**：结合脾脏（主要次级淋巴组织）和肠道淋巴组织（盲肠 tonsil）的多位点采样
2. **时间维度**：区分天然Tregs（CD25+持续表达）与诱导性Tregs（激活后表达）
3. **功能维度**：通过内吞标记（CTLA-4）与分泌标记（TGF-β）的联合检测，实现活体细胞的精准捕获

**应用价值与未来方向**
本研究建立的鸡Tregs鉴定体系（CD4+CD25+GITR+ic-CTLA4+）已成功应用于：
- MDV疫苗研发中的免疫调节剂筛选
- 肠道免疫耐受机制研究（通过盲肠 tonsil采样）
- 兽医临床诊断中禽类自身免疫病的辅助诊断

未来研究建议：
1. 开发鸡源FoxP3荧光素酶报告系统，建立实时动态监测体系
2. 结合代谢组学解析鸡Tregs独特的脂质信号通路（如作为首个发现鸡Tregs中花生四烯酸合成增强的案例）
3. 开展纵向研究，追踪不同日龄鸡群Tregs亚群比例的动态变化

**科学意义**
本研究首次实现鸡Tregs的标准化分离，突破三大技术瓶颈：
1. 解决内吞型CTLA-4的特异性检测难题
2. 建立“基因表达+蛋白定位+功能活性”三位一体鉴定体系
3. 揭示禽类Tregs独特的调控网络（如IL-33/ST2信号通路在肠道免疫中的关键作用）

该成果为禽类免疫学研究提供了标准化技术框架，特别是在：
- 禽类疫苗开发中的免疫原平衡调控
- 禽类人畜共患病（如禽流感）的免疫抑制治疗
- 蛋白质工程（如靶向GITR的免疫调节剂设计）
等领域具有重要应用价值。研究数据已通过ENA（PRJEB88203）和GitHub（https://github.com/esrice/chicken-tregs）完全开源，推动禽类免疫学研究的范式转变。