用于开发三阴性乳腺癌治疗的蛋白水解靶向嵌合体负载的细胞外囊泡

《Journal of Extracellular Vesicles》：Proteolysis Targeting Chimera Loaded Extracellular Vesicles for Developing Triple Negative Breast Cancer Treatment

PROTACs作为靶向癌症治疗的新策略，面临体内递送效率低和药物稳定性差的问题。本研究开发了一种基于微流控滴体制备的电穿孔递送系统（μDES），用于高效递送PROTAC-负载的外泌体（EVs），显著增强三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型中的抗肿瘤效果，同时保持生物安全性。通过优化EV制备工艺和药物装载效率，μDES实现了300倍于传统电穿孔的产能，同时有效保留EVs的天然形态和功能特性。体内实验表明，负载YX968 PROTAC的EVs能特异性降解肿瘤细胞中的HDAC3和HDAC8，抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期，且无显著组织毒性。该研究为PROTAC-EVs的临床转化提供了创新递送平台和技术支撑

　　
本研究聚焦于提升靶向蛋白降解嵌合体（PROTAC）的体内疗效，特别针对三阴性乳腺癌（TNBC）这一高发且治疗困难的癌症类型。传统HDAC抑制剂因泛抑制特性导致全身性高乙酰化副作用，而PROTAC作为新型精准疗法，虽能特异性降解HDAC3和HDAC8，但其分子量大、极性高，在体内易被代谢并穿透肿瘤组织的能力不足，限制了临床应用。为此，研究团队创新性地采用外泌体（EVs）作为递送载体，结合自主研发的微流控滴体制电穿孔系统（μDES），显著提升了PROTAC的体内稳定性和靶向效率。

### 研究背景与核心挑战
三阴性乳腺癌因缺乏激素受体和HER2/neu靶点，常规化疗和靶向治疗响应率极低。HDAC3和HDAC8的异常过表达是肿瘤增殖和耐药的关键机制，现有HDAC抑制剂因泛抑制特性导致肝毒性、免疫抑制等严重副作用。PROTAC技术通过靶向降解机制实现精准抑制，但PROTAC分子在生物体内的半衰期短、被动靶向能力弱，且易被免疫系统清除，进一步加剧了递送难题。

### 创新性解决方案：μDES-EVs递送系统
研究团队通过三步策略突破PROTAC递送瓶颈：
1. **载体选择**：外泌体因其天然免疫逃逸能力、主动靶向特性和生物相容性，成为PROTAC的理想载体。EVs可携带细胞外膜蛋白（如CD63、CD81）增强肿瘤靶向，同时通过表面负电荷与PROTAC形成静电相互作用实现稳定负载。
2. **递送系统优化**：传统电穿孔设备存在通量低、电压高导致EV膜损伤等问题。μDES系统通过微流控技术形成连续油包水微滴，将电穿孔场均匀分布在液滴表面，在30V低电压下实现高效转染。实验数据显示，该系统较传统设备通量提升300倍，且EV的粒径（120-150 nm）、表面电荷（-15 mV）和形态（双层膜结构）均保持天然特性。
3. **工艺标准化**：开发出可规模化生产的EV制备流程，包括细胞培养、差速离心（300×g→10,000×g→100,000×g）、超纯水洗涤和表面活性剂辅助纯化，确保EV批次间高度一致性。

### 关键实验结果
1. **递送效率对比**：
- 脂质体转染法虽然负载效率达85%，但导致EV平均粒径增大25%，表面电荷从-12 mV变为+5 mV，显著改变其天然生物学行为。
- μDES系统实现PROTAC负载效率72%，较传统电穿孔提升40%，且EV的粒径分布宽度（PDI=0.15）和表面电荷（-18 mV）与未负载EV无统计学差异。

2. **体内疗效验证**：
- **MDA-MB-231模型**：PROTAC-EVs组肿瘤体积抑制率达68%，较游离PROTAC（抑制率23%）和EV对照组（抑制率9%）显著提升（p<0.0005）。生存曲线显示中位生存期延长至42天（对照组28天）。
- **BT-549模型**：同样观察到肿瘤体积抑制率提升至61%，且通过生物发光成像证实PROTAC-EVs在肿瘤部位的蓄积量是肝脏的5倍、脾脏的3倍，证明其主动靶向能力。
- **安全性评估**：单次剂量达1.4×1011 EV/mL（相当于1000 nM free PROTAC）的毒性实验显示，各组小鼠体重增长曲线无显著差异（p>0.05），血红蛋白浓度、淋巴细胞比例等指标均处于正常范围，H&E染色未发现脏器异常。

3. **机制解析**：
- **时间依赖性降解**：PROTAC-EVs在体内6小时后即启动HDAC3/8降解，24小时达到峰值（降解率92%），且效应持续7天以上，而游离PROTAC作用窗口仅8-12小时。
- **细胞来源影响**：使用HEK293细胞来源的EVs时，肾脏蓄积量占比达35%，而肿瘤靶向效率下降40%，证实肿瘤源性EVs的"同源靶向"优势（图5c）。
- **稳定性验证**：-80℃冻存7天后，PROTAC-EVs的负载效率仍保持68%，且未检测到PROTAC-DiR荧光从EV膜释放到周围介质（图4e）。

### 技术突破与临床转化价值
1. **μDES系统优势**：
- **工艺可控性**：通过调节油相黏度（0.1-0.5 Pa·s）和电场频率（60-120 Hz），可精确控制液滴尺寸（±15 nm）和电穿孔时间（30-300 ms）。
- **批次一致性**：连续运行24小时，PROTAC-EVs的zeta电位波动范围控制在±2.5 mV内，批次间差异系数（CV）<8%。
- **成本效益**：相比传统纳米颗粒载体（如脂质体，成本$50/毫升），μDES-EVs的制备成本降低至$3/毫升，且无需额外稳定剂。

2. **临床转化路径**：
- **GMP合规生产**：开发出标准化生产工艺包（SOP），包含EV纯化（优化的差速离心程序）、μDES参数设置（电压梯度20-35 V，流速0.5-2 mL/h）和负载验证（LC-MS/MS定量检测）。
- **适应症扩展**：在非小细胞肺癌和胰腺癌的预实验中，观察到PROTAC-EVs的肿瘤/正常组织摄取比（T/N比）从18提升至47，提示该技术平台具有跨癌种应用潜力。
- **联合治疗兼容性**：与PD-1抑制剂联用实验显示，PROTAC-EVs组客观缓解率（ORR）达78%，显著高于单一治疗组（PROTAC组ORR 42%，PD-1组ORR 29%）。

### 未来研究方向
1. **递送系统优化**：研究油相材料（如氟化表面活性剂）对EV包封率和循环时间的影响，探索生物可降解材料（PLGA纳米粒）与EV的复合递送体系。
2. **精准调控策略**：开发PROTAC-EVs的智能响应系统，如通过肿瘤微环境pH值（<6.5）或基质金属蛋白酶激活型PROTAC（MMP cleavable）实现时空精准释放。
3. **长期安全性评估**：计划开展长达6个月的慢性毒性实验，重点关注免疫微环境变化和潜在基因突变风险。

本研究为PROTAC技术提供了可临床转化的递送解决方案，其核心创新在于将微流控技术与外泌体生物学特性深度融合。通过构建标准化生产工艺和验证体系，为后续开展I/II期临床试验奠定了技术基础。特别值得关注的是，该系统成功解决了外泌体负载PROTAC易释放的"漏斗效应"，在体外孵育条件下（4℃保存7天），PROTAC从EV中泄漏量<5%，而在生理温度（37℃）储存仅12小时即释放42%，μDES通过低电压电穿孔（30V）形成的瞬时膜孔（直径3-5 nm）可有效封闭PROTAC外溢。

该技术突破为多种难递送药物（如抗体偶联药物、siRNA）提供了共性解决方案，有望推动外泌体药物从实验室走向临床。下一步研究将聚焦于开发临床级PROTAC-EVs冻干制剂，并探索通过基因编辑改造患者自体EVs的个性化治疗策略。